Mikroinjection af Levende Drosophila Embryoner: Tidlig levering af reagenser til udviklingslandene Embryo

- Saml levende Drosophila embryoner og fjerne deres uigennemsigtige chorions. Derefter, på et glas coverlip, anvende en linje af heptane lim, som er tape lim opløst i flydende heptane. At være i stand til at håndtere den nu dechorionated embryoner, omhyggeligt tilpasse prøverne i træk på klæbemidlet.

Overfør coverlipet til et dehydreringskammer for delvist at udtørre embryonerne. Dette vil forhindre cytoplasmisk lækage under eller efter injektioner.

For at udføre mikroinjektionen skal du bruge et mikroinjektionssystem på et kompatibelt mikroskop. Ved at kigge gennem øjenstykkerne skal du identificere både embryonerne og nålen, der er forudindlæst med injektionsopløsning.

I eksemplet protokol, vil vi se en demonstration af Drosophila embryo mikroinjection for levende billeddannelse undersøgelser af celledeling.

- Før du opsætter coverslip, gøre heptane lim ved at rulle dobbelt-klæbende tape, og placere det i en 100 milliliter flaske. Tilsæt omkring 50 milliliter heptane, forsegle flasken, og rock det i flere dage.

Før du forbereder embryonerne, skal du lave et dehydreringskammer, som embryonerne vil blive placeret i før injektion. For at gøre dette skal du sætte en del af en 35 millimeter skål inde i en 100 millimeter petriskål for at lave et "bord". Tilsæt drierit, som er vandfri calciumsulfat, omkring det, så højden af drieritten ikke er højere end "bordet" og dæk.

For at begynde at forberede embryoner, først indsamle dem fra lå buret ved at ændre druesaft plade med gær hver time. Embryonerne skal afbildes omkring to timer efter starten af samlingen. At forberede coverslip, placere den på den ene side af et mikroskop dias og tape de fire hjørner ned, så det ikke bevæger sig.

Ved hjælp af en bomuldsspidset applikator sættes et lag heptanlim i en linje på dækslet. Limen skal ikke være tyktflydende og skal tørre om et par sekunder. Hvis den er for tyk, tilsæt mere heptane.

Til sidst sættes et stykke dobbeltklæbende tape på diaset ved siden af coverlip. Med en fugtet børste skal du omhyggeligt hente embryonerne fra druesaftpladen og placere dem på dobbeltklæbende tape på diaset.

Brug derefter den ene halvdel af en pincet til at rulle embryonerne over det dobbelte klæbende tape, indtil chorionen bryder op. Hent embryoet ved forsigtigt at rulle det over chorionen, så det klæber til pinceten, og læg det på heptane limen på coverlipet med den lange side af embryoet parallelt med den lange side af dækslet.

Placer 10 til 20 embryoner i én række. Fjern coverlip og læg den i dehydreringskammeret i tre til otte minutter. Tiden afhænger af den lokale luftfugtighed og den mængde, der skal injiceres. Næste, placer coverslip på et metalkammer med vakuumfedt. Endelig dække embryoner med halocarbonolie for at undgå yderligere dehydrering. Embryonerne er nu klar til injektion.

Først skal du finde embryonerne under et 16X mål. Flyt embryonerne væk, og find nålen uden at flytte brændplanet.

For at åbne nålen skal du sætte kanten af coverlipet ind i synsfeltet, men ikke hvor en nål vil være, og sænk nålen til det samme brændplan.

Nu bringe embryonerne i syne. Sænk nålen ind i olien, og sørg for at få pæne væskedråber fra nålen. Støt flytte embryoet ind i nålen, injicere en dråbe i embryoet, og derefter flytte embryoet væk. Efter alle embryoner er blevet injiceret, de er klar til observation på en konfokal mikroskop med en 60 eller en 100X mål.