Micro-injection van Levende Embryo's Drosophila: Vroege Levering van Reagentia aan het Ontwikkelende Embryo

- Verzamel levende Drosophila-embryo's en verwijder hun niet-transparante koraaltjes. Breng vervolgens op een glazen afdeklip een lijn heptaanlijm aan, die tapelijm is opgelost in vloeibaar heptaan. Om de nu gedechorioneerde embryo's te kunnen verwerken, lijnt u de exemplaren voorzichtig op een rij uit op de lijm.

Breng de deklip over in een uitdrogingskamer om de embryo's gedeeltelijk uit tedrogen. Dit voorkomt cytoplasmatische lekkage tijdens of na injecties. Verwijder vervolgens de afdeklip en bedek de embryo's met halokoolstofolie om verdere uitdroging te voorkomen, terwijl zuurstof nog steeds in de embryo's kan verspreiden.

Om de micro-injectie uit te voeren, gebruikt u een micro-injectiesysteem op een compatibele microscoop. Door door de oogstukken te kijken, identificeert u zowel de embryo's als de naald die vooraf is geladen met injectieoplossing. Breek de naald open en zorg ervoor dat deze consistente en geschikte vloeistofdruppels produceert. Breng vervolgens de naald in het embryo en injecteer het juiste volume. Breng de naald naar buiten en ga verder met de volgende, waarbij de injectie voor de resterende embryo's wordt herhaald.

In het voorbeeldprotocol zullen we een demonstratie zien van Drosophila embryomicroinjectie voor live beeldvormingsstudies van celdeling.

- Voordat u de afdeklip instelt, maakt u heptaanlijm door dubbel plakband uit te rollen en in een fles van 100 milliliter te plaatsen. Voeg ongeveer 50 milliliter heptaan toe, sluit de fles af en schommel deze enkele dagen.

Voordat u de embryo's voorbereidt, maakt u een uitdrogingskamer waarin de embryo's vóór de injectie worden geplaatst. Om dit te doen, plaatst u een deel van een schaal van 35 millimeter in een petrischaal van 100 millimeter om een "tafel" te maken. Voeg Drieriet, dat watervrij calciumsulfaat is, eromheen toe, zodat de hoogte van de Drierite niet hoger is dan de "tafel", en dek af.

Om te beginnen met het bereiden van de embryo's, verzamel ze eerst uit de lekenkooi door de druivensapplaat elk uur met gist te verwisselen. De embryo's moeten ongeveer twee uur na het begin van de verzameling worden afgebeeld. Om de deklip te bereiden, plaatst u deze aan één kant van een microscoopschuif en plakt u de vier hoeken naar beneden, zodat deze niet beweegt.

Doe met behulp van een applicator met katoenen punt een laag heptaanlijm in een lijn op de coverlip. De lijm mag niet stroperig zijn en moet binnen een paar seconden drogen. Als het te dik is, voeg dan meer heptaan toe.

Leg ten slotte een stuk dubbel plakband op de glijbaan naast de afdeklip. Pak met een bevochtigde borstel de embryo's voorzichtig van de druivensapplaat en leg ze op de dubbele plakband op de glijbaan.

Gebruik vervolgens de helft van een pincet om de embryo's over de dubbele plakband te rollen totdat het koraal openbreekt. Pak het embryo op door het voorzichtig over het koraal te rollen, zodat het aan het pincet blijft plakken en plaats het op de heptaanlijm op de coverlip met de lange kant van het embryo evenwijdig aan de lange kant van de coverslip.

Plaats 10 tot 20 embryo's op één rij. Verwijder de afdeklip en plaats deze drie tot acht minuten in de uitdrogingskamer. De tijd hangt af van de lokale vochtigheid en de hoeveelheid die moet worden geïnjecteerd. Plaats vervolgens de afdeklip op een metalen kamer met vacuümvet. Bedek ten slotte de embryo's met halokoolstofolie om verdere uitdroging te voorkomen. De embryo's zijn nu klaar voor injectie.

Zoek eerst de embryo's onder een 16X-doel. Beweeg de embryo's weg en vind de naald zonder het brandpuntsvlak te bewegen. Centreer de naald en beweeg deze omhoog zonder deze in de X- of Y-richting te bewegen.

Om de naald te openen, plaatst u de rand van de afdeklip in het gezichtsveld, maar niet waar een naald zich bevindt, en laat u de naald op hetzelfde brandpuntsvlak zakken. Beweeg de afdeklip heel voorzichtig totdat deze de naald raakt en breekt deze voorzichtig open. Beweeg de naald omhoog.

Breng nu de embryo's in beeld. Laat de naald in de olie zakken en zorg ervoor dat u mooie vloeibare druppels uit de naald haalt. Verplaats het embryo gestaag in de naald, injecteer een druppel in het embryo en verplaats het embryo vervolgens weg. Nadat alle embryo's zijn geïnjecteerd, zijn ze klaar voor observatie op een confocale microscoop met een 60 of een 100X-doel.