Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- לאסוף עוברים חיים Drosophila ולהסיר chorions שאינם שקופים שלהם. לאחר מכן, על כיסוי זכוכית, להחיל שורה של דבק heptane, שהוא דבק קלטת מומס heptane נוזלי. כדי להיות מסוגל להתמודד עם העוברים עכשיו הושמד, בזהירות ליישר את הדגימות ברציפות על דבק.
להעביר את coverlip לתוך תא התייבשות כדי לייבש חלקית את העוברים. זה ימנע דליפה ציטופלסמית במהלך או אחרי זריקות. הבא, להסיר את coverlip ולכסות את העוברים עם שמן halocarbon כדי למנוע התייבשות נוספת תוך מתן חמצן להתפזר לתוך העוברים.
כדי לבצע את המיקרו-injection, השתמש במערכת microinjection על מיקרוסקופ תואם. על ידי התבוננות דרך חתיכות העיניים, לזהות הן את העוברים ואת המחט טעון מראש עם פתרון הזרקה. לשבור לפתוח את המחט ולהבטיח כי הוא מייצר טיפות נוזליות עקביות בגודל מתאים.
בפרוטוקול הדוגמה, נראה הדגמה של מיקרו-לינקציה של עוברי דרוזופילה למחקרי הדמיה חיה של חלוקת תאים.
- לפני הגדרת כיסוי, להפוך דבק heptane על ידי unrolling סרט דביק כפול, ומניחים אותו בבקבוק 100 מיליליטר.
לפני הכנת העוברים, לעשות תא התייבשות כי העוברים יונחו לפני ההזרקה. כדי לעשות זאת, לשים חלק אחד של צלחת 35 מילימטר בתוך צלחת פטרי 100 מילימטר לעשות "שולחן".
כדי להתחיל להכין את העוברים, ראשית לאסוף אותם מכלוב שכב על ידי שינוי צלחת מיץ ענבים עם שמרים בכל שעה. העוברים צריכים להיות בתמונה כשעתיים לאחר תחילת האוסף.
באמצעות מוליך כותנה, לשים שכבה אחת של דבק heptane בשורה על coverslip. הדבק לא צריך להיות צמיג צריך להתייבש בעוד כמה שניות. אם הוא עבה מדי, להוסיף עוד heptane.
לבסוף, שים חתיכת סרט הדבקה דביק כפול על השקופית ליד ה-coverslip. עם מברשת לחה, בזהירות להרים את העוברים מצלחת מיץ ענבים ומניחים אותם על קלטת דביקה כפולה על השקופית.
לאחר מכן, השתמש בחצי פינצ'ר כדי לגלגל את העוברים מעל הקלטת הדביקה הכפולה עד שהכוריון ייפתח.
מניחים 10 עד 20 עוברים בשורה אחת. הסר את העטיפה והנח אותה בתא ההתייבשות במשך שלוש עד שמונה דקות. הזמן תלוי בלחות המקומית ובכמות שיש להזריק.
ראשית, למצוא את העוברים תחת מטרה 16X. להזיז את העוברים משם, ולמצוא את המחט מבלי להזיז את המישור המוקד. מרכז את המחט ולהזיז אותו מבלי להזיז אותו בכיוון X או Y.
כדי לפתוח את המחט, לשים את קצה הכיסוי לתוך שדה הראייה, אבל לא איפה מחט יהיה, ולהוריד את המחט לאותו מישור מוקד.
עכשיו להביא את העוברים לתצוגה. להוריד את המחט לתוך השמן, ולוודא להשיג טיפות נוזלי נחמד מן המחט. בהתמדה להעביר את העובר לתוך המחט, להזריק טיפה לתוך העובר, ולאחר מכן להזיז את העובר משם. אחרי כל העוברים הוזרקו, הם מוכנים להשגחה על מיקרוסקופ confocal עם מטרה 60 או 100X.
