Microiniezione di embrioni vivi di Drosophila: consegna precoce dei reagenti all'embrione in via di sviluppo

- Raccogliere embrioni di Drosophila vivi e rimuovere i loro corioni non trasparenti. Quindi, su un coverslip di vetro, applicare una linea di colla di eptano, che è adesivo a nastro sciolto in eptano liquido. Per essere in grado di gestire gli embrioni ora dechorionati, allineare accuratamente i campioni di fila sull'adesivo.

Trasferire il coverslip in una camera di disidratazione per essiccare parzialmente gli embrioni. In questo modo si eviteranno perdite citoplasmatici durante o dopo le iniezioni. Successivamente, rimuovere il coperchio e coprire gli embrioni con olio di alocarbonio per evitare un'ulteriore disidratazione pur consentendo all'ossigeno di diffondersi negli embrioni.

Per eseguire la microiniezione, utilizzare un sistema di microiniezione su un microscopio compatibile. Guardando attraverso gli occhi i pezzi, identificare sia gli embrioni che l'ago precaricati con la soluzione di iniezione. Aprire l'ago e assicurarsi che produca gocce liquide coerenti e di dimensioni adeguate. Quindi, portare l'ago all'interno dell'embrione e iniettare il volume appropriato. Espellere l'ago e procedere a quello successivo, ripetendo l'iniezione per gli embrioni rimanenti.

Nel protocollo di esempio, vedremo una dimostrazione della microiniezione dell'embrione Drosophila per studi di imaging dal vivo della divisione cellulare.

- Prima di impostare il coverslip, fare la colla di eptano srotolando il nastro adesivo doppio e posizionandolo in una bottiglia da 100 millilitri. Aggiungere circa 50 millilitri di eptano, sigillare la bottiglia e scuoterla per diversi giorni.

Prima di preparare gli embrioni, fare una camera di disidratazione in cui verranno collocati gli embrioni prima dell'iniezione. Per fare questo, mettere una parte di una piastra di 35 millimetri all'interno di una piastra di Petri da 100 millimetri per fare un "tavolo".

Per iniziare a preparare gli embrioni, raccoglierli prima dalla gabbia di laica cambiando ogni ora il piatto di succo d'uva con il lievito. Gli embrioni devono essere coniati circa due ore dopo l'inizio della raccolta. Per preparare il coverslip, posizionarlo su un lato di uno scivolo al microscopio e fissare i quattro angoli verso il basso, in modo che non si muova.

Utilizzando un applicatore con punta di cotone, mettere uno strato di colla di eptano in una linea sul coperchio. La colla non deve essere viscosa e asciugare in pochi secondi. Se è troppo spessa, aggiungere altro eptano.

Infine, mettete un pezzo di nastro adesivo doppio sullo scivolo accanto al coverslip. Con un pennello inumidito, raccogliete con cura gli embrioni dal piatto di succo d'uva e posizionateli sul nastro adesivo doppio sullo scivolo.

Quindi, utilizzare la metà di una pinzetta per arrotolare gli embrioni sul nastro adesivo doppio fino a quando il chorion non si apre. Raccogliere l'embrione rotolando delicatamente sopra il chorion, in modo che si attacchi al tweezer e posizionarlo sulla colla di eptano sul coverslip con il lato lungo dell'embrione parallelo al lato lungo del copricapo.

Posizionare da 10 a 20 embrioni in una riga. Rimuovere il coperchio e posizionarlo nella camera di disidratazione per tre o otto minuti. Il tempo dipende dall'umidità locale e dalla quantità da iniettare. Successivamente, posizionare il coverslip su una camera metallica con grasso sottovuoto. Infine, coprire gli embrioni con olio di alocarbonio per evitare un'ulteriore disidratazione. Gli embrioni sono ora pronti per l'iniezione.

Per prima cosa, trovate gli embrioni sotto un obiettivo 16X. Allontanate gli embrioni e trovate l'ago senza spostare il piano focale. Centrare l'ago e spostarlo verso l'alto senza spostarlo nella direzione X o Y.

Per aprire l'ago, posizionare il bordo della coverslip nel campo visivo, ma non dove si trova un ago, quindi abbassare l'ago allo stesso piano focale. Spostare con molta attenzione il coverslip fino a quando non colpisce l'ago e lo apre delicatamente. Spostare l'ago verso l'alto.

Ora portate gli embrioni in vista. Abbassate l'ago nell'olio e assicuratevi di ottenere belle gocce liquide dall'ago. Spostare costantemente l'embrione nell'ago, iniettare una goccia nell'embrione e quindi allontanare l'embrione. Dopo che tutti gli embrioni sono stati iniettati, sono pronti per l'osservazione al microscopio confocale con un obiettivo 60 o 100X.