Микроинъекция живых эмбрионов дрозофилы: Ранняя доставка реагентов в развивающийся эмбрион

- Соберите живые эмбрионы дрозофила и удалите их непрозрачные хорионы. Затем, на стеклянную крышку, нанесите линию гептаного клея, который является ленточный клей растворяется в жидком гептане. Чтобы иметь возможность обрабатывать теперь дехорионированных эмбрионов, тщательно выровнять образцы в ряд на клей.

Передача крышки в камеру обезвоживания, чтобы частично высохшей эмбрионов. Это предотвратит цитоплазмическую утечку во время или после инъекций. Далее, удалить крышку и покрыть эмбрионы галоуглеродным маслом, чтобы предотвратить дальнейшее обезвоживание, в то же время позволяя кислороду рассеиваться в эмбрионы.

Для выполнения микроинъекции используйте систему микроинъекции на совместимом микроскопе. Глядя сквозь глаза, определите как эмбрионы, так и иглу, предварительно зазагруженную инъекционным раствором. Разбейте иглу и убедитесь, что она производит последовательные и соответствующие размеры жидких капель. Затем принесите иглу внутрь эмбриона и ввись соответствующий объем.

В примере протокола, мы увидим демонстрацию микроинъекции эмбриона Дрозофилы для живых исследований изображений деления клеток.

- Перед настройкой крышки, сделать гептан клей путем разворачивания двойной липкой лентой, и поместить его в бутылку 100 миллилитров. Добавить около 50 миллилитров гептана, печать бутылки, и рок его в течение нескольких дней.

Перед подготовкой эмбрионов, сделать обезвоживание камеры, что эмбрионы будут помещены в до инъекции. Для этого, положить одну часть 35-миллиметровой тарелки внутри 100 миллиметров Петри блюдо, чтобы сделать "стол". Добавить Drierite, который является сульфатом кальция ангидроуса, вокруг него так, что высота Drierite не выше, чем "стол", и крышка.

Чтобы начать подготовку эмбрионов, сначала соберите их из клетки, меняя тарелку виноградного сока с дрожжами каждый час. Эмбрионы должны быть изображены примерно через два часа после начала сбора.

Используя аппликатор с хлопчатобумажной наконечником, положите один слой гептаного клея в линию на крышке. Клей не должен быть вязким и должен высохнуть в течение нескольких секунд. Если он слишком толстый, добавьте больше гептана.

Наконец, положите кусок двойной липкой ленты на слайд рядом с крышкой. С увлажненной щеткой, тщательно забрать эмбрионы из виноградного сока пластины и поместить их на двойной липкой лентой на слайде.

Далее используйте одну половину пинцета, чтобы свернуть эмбрионы над двойной липкой лентой до тех пор, пока хорион не откроется. Возьмите эмбрион, аккуратно перекатывая его над хорионом, чтобы он прилипает к пинцету, и поместите его на гептаном клее на крышке с длинной стороной эмбриона параллельно длинной стороне крышки.

Поместите от 10 до 20 эмбрионов в один ряд. Удалите крышку и поместите ее в камеру обезвоживания на три-восемь минут. Время зависит от локальной влажности и количества, которое необходимо ввести. Далее поместите крышку на металлическую камеру с вакуумной смазкой. Наконец, накройте эмбрионы галоуглеродным маслом, чтобы избежать дальнейшего обезвоживания.

Во-первых, найти эмбрионы под 16X цели. Переместить эмбрионы прочь, и найти иглу, не перемещая фокусной плоскости. Центр иглы и переместить его вверх, не перемещая его в направлении X или Y.

Чтобы открыть иглу, положите край крышки в поле зрения, но не там, где игла будет, и опустите иглу в ту же фокусную плоскость.

Теперь довести эмбрионы в поле зрения. Нижняя игла в масло, и убедитесь, что получить хороший жидких капель из иглы. Устойчиво переместить эмбрион в иглу, ввести каплю в эмбрион, а затем переместить эмбрион прочь. После того, как все эмбрионы были введены, они готовы к наблюдению на конфокальном микроскопе с 60 или 100X цели.