Larval Ring Drüsensektion: Isolierung der entwicklungsfreien endokrinen Organe von Drosophila

- Um die Ringdrüse zu sezieren, benötigen Sie ein Sezieren Mikroskop, zwei Zangen, eine Feine Spurnadel, um als Seziermesser zu dienen, und eine gepufferte Lösung. Finden Sie die Ringdrüse durch die Identifizierung des Kopfes der Larven, die die Mundhaken enthält. Reisen Sie entlang der Länge der Larven, um das Gehirn zu finden, die zwischen dem Thorax und den Bauchabschnitten ist.

Die Larvenringdrüse ist eine komplexe endokrine Struktur, die drei verschiedene endokrine Organe enthält. Das Corpus allatum sitzt in der Mitte der Ringdrüse und produziert ein jugendliches Hormon, das die Entwicklung und Alterung reguliert. Die prothorakale Drüse umgibt das Corpus allatum und bildet den Großteil der Struktur. Ecdyson, ein Hormon, das an Insektenmälzerei beteiligt ist, wird durch diese Drüse hergestellt. Unterhalb der prothorakalen Drüse befindet sich das Corpus cardiacum, das adipopetische Hormon produziert, ein Nährstoffregulator.

In diesem Beispiel werden wir Larvenhirne und Ringdrüsen für die Immunhistochemie sezieren.

- Nach der Vorbereitung der Larven, beginnen Sie den Kurs Dissektion in einer drei Zentimeter Schale mit PBS unter einem Sezieren Mikroskop gefüllt. Zuerst greifen Sie den Mundhaken mit Zange. Dann, mit Mikroschere, trennen Sie den Körper bei etwa einem Drittel der Länge von der vorderen Spitze. Als nächstes halten Sie die vordere Länge mit einem Paar Zangen und verwenden Sie ein zweites Paar, um sanft die Spitze des Körpers zu drücken.

Bereiten Sie bis zu 20 Larven auf diese Weise innerhalb von 10 Minuten vor und geben Sie sie dann in fixative Lösung. Nach 30 Minuten die Präparate waschen und mit der Immunostainierung fortfahren. Nach der Immunfärbung der Larven verwenden Sie eine Einwegpipette, um die Proben auf eine mit 0,3% PBT gefüllte Schale zu übertragen.

Greifen Sie unter einem Sezierendes Mikroskop die Nagelhaut oder den Mundhaken mit einer Zange. Verwenden Sie dann eine 27-Spur-Nadel, die wie ein Messer an einer Ein-Milliliter-Spritze befestigt ist, um den Hirnring-Drüsen-Augen-Scheibenkomplex aus der Körpernagelhaut zu entfernen, indem Sie die vordere Spitze der Speiseröhre und der Augenscheiben abschneiden.

Als nächstes trennen Sie mit Zangen vorsichtig die Speiseröhre und den Darm vom Hirnring-Drüsen-Augen-Scheibenkomplex. Ziehen Sie den Darm zur hinteren Seite heraus, da die Speiseröhre durch das Gehirn über der ventralen Nervenschnur verläuft. Um schließlich den Hirnring-Drüsenkomplex zu isolieren, schneiden Sie vorsichtig die Verbindungen zwischen der Gehirnscheibe, den Augenscheiben und den Beinscheiben mit einem Nadelmesser.

- Es ist sehr wichtig, feine Zangen mit scharfen Kanten während der Zerlegung zu verwenden. Ich empfehle auch dringend, dass Sie Zangen mit einem Arkansas Schleifstein schärfen, um ihre Kanten ohne Lücken zusammenzuführen.

- Um die Proben zu übertragen, verwenden Sie eine Mikropipette mit einer breiten Bohrungsspitze. Legen Sie die Proben auf die Mitte des Glasschlittens. Dann verwenden Sie Zangen, um die Proben auf ihre ventralen Seiten zu positionieren, so dass die Ringdrüse, die sich auf der dorsalen Seite des Gehirns befindet, abgebildet werden kann. Als nächstes kippen Sie den Schlitten und wischen Sie so viel wie möglich von der überschüssigen PBT ab. Dann legen Sie einen Tropfen Montagereagenz in der Nähe der Proben und verwenden Sie Zangen, um langsam einen Deckelrutsch über dem Reagenz zu senken, und dann über die Proben.