Larva Halka Bezi Diseksiyonu: Drosophila'dan Gelişimsel Endokrin Organların İzolasyonu

- Halka bezini parçalamak için, bir diseksiyon mikroskobu, iki forseps, bir diseksiyon bıçağı olarak hizmet etmek için ince bir gösterge iğnesi ve tamponlu bir çözeltiye ihtiyacınız olacak. Ağız kancalarını içeren larvaların başını tanımlayarak halka bezini bulun. Toraks ve karın bölümleri arasında kalan beyni bulmak için larvaların uzunluğu boyunca seyahat edin. Halka bezi beyinden daha küçüktür ve üstte bulunur.

Larva halka bezi, üç farklı endokrin organ içeren karmaşık bir endokrin yapıdır. Corpus allatum halka bezinin ortasına oturur ve gelişimi ve yaşlanmayı düzenleyen juvenil hormon üretir. Protorasik bez korpus allatumunu çevreler ve yapının çoğunluğunu oluşturur. Böcek maltlamada yer alan bir hormon olan Ecdysone, bu bez tarafından yapılır. Protorasik bezin altında, bir besin düzenleyici olan adipokinetik hormonu üreten korpus kardiyak vardır.

Bu örnekte, immünostokinoloji için larva beyinlerini ve halka bezlerini inceleyeceğiz.

- Larvaları hazırladıktan sonra, parçalayıcı bir mikroskop altında PBS ile dolu üç santimetrelik bir tabakta ders diseksiyonuna başlayın. İlk olarak, ağız kancasını ön uçlarla kavrayın. Sonra, mikro makas kullanarak, ön uçtan uzunluğun yaklaşık üçte birinde gövdeyi kesin.

10 dakika içinde 20'ye kadar larvayı bu şekilde hazırlayın ve daha sonra fiksatif çözeltiye aktarın. 30 dakika sonra, preparatları yıkayın ve immünostaining ile devam edin. Larvaları immün olarak etkiledikten sonra, örnekleri% 0.3 PBT ile dolu bir tabağa aktarmak için tek kullanımlık bir pipet kullanın.

Bir diseksiyon mikroskobu altında, kütikül veya ağız kancasını bir çift ön ayakla kavrayın.

Daha sonra, toparlama kullanarak yemek borusunu ve bağırsağı beyin-halka bezi- göz diski kompleksinden dikkatlice ayırın. Yemek borusu ventral sinir kordonu üzerindeki beyinden geçtiğinden, bağırsakları arka tarafa çekin. Son olarak, beyin halkası bezi kompleksini izole etmek için, beyin diski, göz diskleri ve bacak diskleri arasındaki bağlantıları bir iğne bıçağıyla dikkatlice kesin.

- Diseksiyon sırasında keskin kenarlı ince forseps kullanmak oldukça önemlidir. Ayrıca, kenarlarını boşluk bırakmadan bir araya getirmek için forsepsleri arkansas taşlama taşı ile keskinleştirmenizi şiddetle tavsiye ederim.

- Numuneleri aktarmak için geniş delikli uçlu bir mikropipette kullanın. Daha sonra, örnekleri ventral yanlarına konumlandırmak için önlük kullanın, böylece beynin dorsal tarafında bulunan halka bezi görüntülenebilir. Sonra, kaydırağı eğin ve fazla PBT'nin mümkün olduğunca çoğunu silin. Sonra, örneklerin yanına bir damla montaj reaktifi koyun ve bir kapak kapağını reaktifin üzerine ve ardından numunelerin üzerine yavaşça indirmek için önlük kullanın.