Temperaturgradientanalyse: En metode til at teste temperaturpræference i Drosophila Larver

- For at teste temperaturpræferencen for Drosophila larver, skabe en temperaturgradient ved at opvarme den ene side af en aluminiumsanalyseplade og køle den anden. Aluminium har høj termisk ledningsevne, hvilket betyder, at varmen overføres effektivt, hvilket skaber en stabil lineær temperaturgradient. Efter at systemet er ekvilibreret, skal du registrere temperaturerne på tværs af pladen i temperaturzoner af samme størrelse og derefter indlæse midten af pladen med rene larver.

Dæk hele systemet for at fjerne interferens fra stærkt lys og starte forsøget. Larver distribuerer gennem gradienten, undgår aversive zoner, der er for varme eller for kolde, og bosætter sig i zoner med gunstige temperaturer. Denne adfærd kaldes termotaxis. For at vurdere larvernes temperaturpræference skal du registrere antallet af dyr i hver temperaturzone.

I eksempelprotokollen vil vi se, hvordan man opsætter en enkeltretningstemperaturgradient mellem 18 og 28 grader Celsius, og hvordan larver håndteres under analysen.

- For at forberede en enkelt retningsbestemt gradient, for det første skabe et fugtigt omgivende miljø for analysen. Placer to aluminiumsblokke forbundet med separate vandbade på våde papirhåndklæder 10 centimeter fra hinanden. Vandbadene skal opvarmes på forhånd. Næste, lav 100 milliliter 1% agarose og tilsæt 25 milliliter til hver analyseplade på en plan overflade. Når agarose er størknet, gnid forsigtigt overfladen med en melaminsvamp for at gøre overfladen lidt grov.

Derefter, for at fremme effektiv temperaturoverførsel, skal du udfylde eventuelle huller mellem aluminiumsblokkene i analysepladerne med vand leveret fra en sprøjteflaske. Nu skal du placere analysepladerne på aluminiumsblokkene og sørge for, at afgrænsningerne er 2 centimeter fra begge kanter for nøjagtigt at matche aluminiumsblokkenes kanter.

Derefter sprøjtes en film af vand på overfladen af pladerne, så gelerne ikke tørrer ud. Derefter skal du dække systemet med en papkasse for at reducere fordampning og hjælpe med at stabilisere temperaturen på geloverfladen. Vent i 5 til 10 minutter for at lade temperaturen ekvilibrere. Kontroller derefter overfladetemperaturen på pladen på mindst 12 steder for at sikre, at der er en jævn temperatur overalt, giv eller tag 2 grader Celsius. Derefter skal du udskifte kassedækslet, indtil analysen er udført.

Først skal du fjerne papkassen over gelen og hurtigt kontrollere geloverfladetemperaturen. Hvis overfladen er tør, skal du sprøjte en lille mængde vand på overfladen. Hvis gelen er god, skal du indlæse 100 til 200 larver i midten af hver plade ved hjælp af en lille pensel. Derefter skal du placere et låg over hver analyseplade for at fange larverne og dække opsætningen med en papkasse for at forhindre lyseksponering. Analysen er nu i gang.

Efter 10 til 30 minutter skal du fjerne papkassen og mikropladelåget. Derefter fotograferes pladerne ovenfra for at registrere larvernes position. Placer kassen over kameraet for at undgå refleksion på gelens overflade. For at rydde op på pladen skal du suge alle larverne, uanset hvor de måtte have spredt sig.

Beregn nu den procentvise fordeling af larver i hver zone ved hjælp af billedanalysesoftware. Lav linjer hver 2 centimeter baseret på afgrænsningerne på analysepladen og tæl antallet af larver i hver zone.

- Når du tæller, ignorere larver fordelt i regioner 0,5 centimeter fra hver kant. Gel tykkelse og temperaturforhold er ikke ensartet nær kanten.