Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Encyclopedia of Experiments
Encyclopedia of Experiments: Biology

A subscription to JoVE is required to view this content.

Temperatuurgradiënttest

 
Click here for the English version

Temperatuurgradiënttest: een methode om de temperatuurvoorkeur bij Drosophila-larven te testen

Article

Transcript

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

- Om de temperatuurvoorkeur van Drosophila-larven te testen, creëert u een temperatuurgradiënt door de ene kant van een aluminium testplaat te verwarmen en de andere te koelen. Aluminium heeft een hoge thermische geleidbaarheid, wat betekent dat de warmte efficiënt wordt overgebracht, waardoor een stabiele lineaire temperatuurgradiënt ontstaat. Nadat het systeem is geëquilibreerd, registreert u de temperaturen over de plaat in temperatuurzones van dezelfde grootte en laadt u vervolgens het midden van de plaat met schone larven.

Bedek het hele systeem om interferentie door fel licht te elimineren en start de proef. Larven verspreiden zich door de gradiënt, vermijden aversieve zones die te warm of te koud zijn en vestigen zich in zones met gunstige temperaturen. Dit gedrag wordt thermotaxis genoemd. Om de temperatuurvoorkeur van de larven te beoordelen, registreert u het aantal dieren in elke temperatuurzone.

In het voorbeeldprotocol zullen we zien hoe we een temperatuurgradiënt in één richting tussen 18 en 28 graden Celsius kunnen instellen en hoe larven worden behandeld tijdens de test.

- Om een enkele richtingsgradiënt voor te bereiden, moet u eerst een vochtige omgeving creëren voor de test. Plaats twee aluminium blokken verbonden met afzonderlijke waterbaden op natte papieren handdoeken op 10 centimeter van elkaar. De waterbaden moeten van tevoren worden opgewarmd. Maak vervolgens 100 milliliter van 1% agarose en voeg 25 milliliter toe aan elke assayplaat op een vlak oppervlak. Zodra de agarose is gestold, wrijft u het oppervlak voorzichtig in met een melaminespons.

Vul vervolgens, om een efficiënte temperatuuroverdracht te bevorderen, eventuele openingen tussen de aluminium blokken in de testplaten met water uit een spuitfles. Plaats nu de assayplaten op de aluminium blokken en zorg ervoor dat de afbakeningen 2 centimeter van beide randen verwijderd zijn om precies overeen te komen met de randen van de aluminium blokken.

Spuit vervolgens een film water op het oppervlak van de platen, zodat de gels niet uitdrogen. Bedek vervolgens het systeem met een kartonnen doos om verdamping te verminderen en de temperatuur van het geloppervlak te stabiliseren. Wacht 5 tot 10 minuten om de temperatuur te laten gelijktrekken. Controleer vervolgens de oppervlaktetemperatuur op de plaat op ten minste 12 locaties om ervoor te zorgen dat er overal een gelijkmatige temperatuur is, geef of neem 2 graden Celsius. Vervang vervolgens de doosafdekking totdat de test is uitgevoerd.

Verwijder eerst de kartonnen doos over de gel en controleer snel de oppervlaktetemperatuur van de gel. Als het oppervlak droog is, spuit dan een kleine hoeveelheid water op het oppervlak. Als de gel goed is, laad dan 100 tot 200 larven in het midden van elke plaat met behulp van een kleine kwast. Plaats vervolgens een deksel over elke testplaat om de larven te vangen en bedek de opstelling met een kartonnen doos om blootstelling aan licht te voorkomen. De test is nu aan de gang.

Verwijder na 10 tot 30 minuten de kartonnen doos en het deksel van de microplaat. Fotografeer vervolgens de platen van bovenaf om de positie van de larven vast te leggen. Plaats de doos boven de camera om reflectie op het oppervlak van de gel te voorkomen. Om de plaat op te ruimen, aspireert u alle larven waar ze zich ook hebben verspreid.

Bereken nu de procentuele verdeling van larven in elke zone met behulp van beeldanalysesoftware. Maak lijnen om de 2 centimeter op basis van de afbakeningen op de testplaat en tel het aantal larven in elke zone.

- Negeer bij het tellen larven verdeeld in gebieden op 0,5 centimeter van elke rand. Geldikte en temperatuuromstandigheden zijn niet uniform in de buurt van de rand.

Tags

Lege waarde probleem
Read Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter