Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- For å teste temperaturpreferansen til Drosophila larver, skape en temperaturgradient ved å varme opp den ene siden av en aluminiumsanalyseplate og kjøle den andre. Aluminium har høy termisk ledningsevne, noe som betyr at varmen overføres effektivt, og skaper en stabil lineær temperaturgradient. Etter at systemet har likevektet, registrer temperaturene over platen i samme størrelse temperatursoner, og last deretter midten av platen med rene larver.
Dekk hele systemet for å eliminere forstyrrelser fra sterkt lys og start studien. Larver distribuerer gjennom gradienten, unngår aversive soner som er for varme eller for kalde, og bosetter seg i soner med gunstige temperaturer. Denne oppførselen kalles thermotaxis. For å vurdere larvenes temperaturpreferanse, registrer antall dyr i hver temperatursone.
I eksempelprotokollen vil vi se hvordan du setter opp en enveis temperaturgradient mellom 18 og 28 grader Celsius, og hvordan larver håndteres under analysen.
- For å forberede en enveis gradient, først, lag et fuktig omgivelsesmiljø for analysen. Plasser to aluminiumsblokker koblet til separate vannbad på våte papirhåndklær 10 centimeter fra hverandre. Vannbadene må varmes opp på forhånd. Deretter lager du 100 milliliter med 1% agarose og tilsetter 25 milliliter til hver analyseplate på en jevn overflate. Når agarose har størknet, gni forsiktig overflaten med en melaminsvamp for å gjøre overflaten litt grov.
Deretter, for å fremme effektiv temperaturoverføring, fyll eventuelle hull mellom aluminiumsblokkene i analyseplatene med vann levert fra en sprøyteflaske. Nå, plasser analyseplatene på aluminiumsblokkene og sørg for at avgrensningene er 2 centimeter fra hver kant for å nøyaktig matche kantene på aluminiumsblokkene.
Spray deretter en film med vann på overflaten av platene slik at gelene ikke tørker ut. Deretter dekker du systemet med en pappkasse for å redusere fordampning og bidra til å stabilisere temperaturen på geloverflaten. Vent i 5 til 10 minutter for å la temperaturen likevekte. Kontroller deretter overflatetemperaturen på platen på minst 12 steder for å sikre at det er en jevn temperatur gjennom hele, gi eller ta 2 grader Celsius. Deretter bytter du ut eskens deksel til analysen er utført.
Fjern først pappesken over gelen og kontroller raskt geloverflatetemperaturen. Hvis overflaten er tørr, spray en liten mengde vann på overflaten. Deretter legger du et lokk over hver analyseplate for å fange larver og dekke oppsettet med en pappkasse for å forhindre lyseksponering.
Etter 10 til 30 minutter, fjern pappesken og mikroplatelokket. Deretter fotograferer du platene ovenfra for å registrere larvens posisjon. Plasser boksen over kameraet for å unngå refleksjon på overflaten av gelen. For å rydde opp platen, aspirer alle larver uansett hvor de måtte ha spredt seg.
Beregn nå den prosentvise fordelingen av larver i hver sone ved hjelp av bildeanalyseprogramvare. Lag linjer hver 2 centimeter basert på avgrensningene på analyseplaten og tell antall larver i hver sone.
- Ved telling, ignorer larver fordelt i regioner 0,5 centimeter fra hver kant. Geltykkelse og temperaturforhold er ikke ensartede nær kanten.
