Drosophila Aktivitetsmonitor (DAM): En metode til måling af lokomotivaktivitet i fluer

- Den Drosophila Activity Monitor, eller DAM, holder centreret aktivitet rør udstyret med flue mad i den ene ende og en luftgennemtrængelig tættere på den anden. Denne opsætning rummer enkelt fluer under eksperimenter varer flere dage eller endda uger.

Placer DAM i et kontrolleret miljø som en inkubator med indstillet temperatur, fugtighed og lyscyklus. Udfør eksperimentet i et mørkt rum, og brug om nødvendigt en infrarød lyskilde til at håndtere enheden, som i modsætning til stærkt lys ikke påvirker fluens døgnrytmesystem.

For at registrere lokomotorisk aktivitet skal du tilslutte apparatet til et computersystem, der gemmer aflæsningerne fra DAM's detektorer. DAM's elektronik registrerer kontinuerligt integriteten af en infrarød stråle, der udsendes gennem midten af hvert rør og regelmæssigt uploader data til computersystemet.

Da fluen går frem og tilbage inde i røret, krydser den den infrarøde stråle. Disse afbrydelser tælles af DAM over tid for hvert rør og tjener som et mål for flyveaktivitet.

I den følgende protokol vil vi bruge DAM-systemet til at studere cirkadiske rytmer hos Drosophila voksne mænd.

- Før du læsser fluer i aktivitetsrør, skal du tænde for de inkubatorer, der skal bruges til at huse aktivitetsmonitorerne. Juster temperaturen ved hjælp af inkubatorkontrollerne, og indstil lys-/mørkeregimet ved hjælp af DAM-systemets lysstyringscontroller eller inkubatorens eget lysstyringssystem i overensstemmelse med det ønskede eksperimentelle design.

Derefter bedøve fluerne med kuldioxid. Derefter overfører du forsigtigt en enkelt flue til et aktivitetsrør. Grib midten af et enkelt stykke garn, der er omkring en halv tomme med fine pincet og indsæt garnet i den non-food ende af aktivitetsrøret for at tilslutte åbningen og forhindre fluen i at undslippe under eksperimentet, mens det samtidig tillader luftstrøm i røret.

Hold røret lagt på sin side, indtil fluen vågner for at forhindre fluen i at sidde fast på maden. Indsæt rørene i aktivitetsmonitorerne. Med den nyere, mere kompakte model af TriKinetics-skærmene er det nødvendigt at holde rørene på plads med elastikker for at sikre, at den infrarøde stråle passerer røret i midterpositionen.

Endelig skal du sætte aktivitetsmonitorerne i inkubatorerne og tilslutte dem til dataindsamlingssystemet via telefonledningerne. Kontroller ved hjælp af DAM-systemindsamlingssoftwaren, at alle skærme er tilsluttet korrekt, og at data indsamles fra hver af dem.

Nu, hvor fluerne er blevet indlæst i aktivitetsrørene, og det lokomotoriske aktivitetsovervågningssystem er klar, kan dataene nu registreres. Fluer synkroniseres og trænes ved at udsætte dem for det ønskede lys / mørke eller LD og temperaturregime i to til fem hele dage. Den mest almindeligt anvendte entrainment-tilstand er en lys / mørk cyklus på 12 timers lys / 12 timer mørk ved 25 grader Celsius.

Til undersøgelse af døgnrytmen i forhold til denne protokol defineres det tidspunkt, hvor lysene tændes i inkubatoren, som zeitgebertid 0, og alle andre tider er relative i forhold til denne værdi. Under standard 12:12 LD-forhold udviser vild type Drosophila melanogaster typisk to anfald af aktivitet; en centreret omkring ZT0, formuleret morgentop og en anden omkring ZT12, formuleret aftentop.

Fritløbende bevægelsesmotoriske aktivitetsrytmer måles under konstante mørke og temperaturforhold efter indkøringsperioden.

Generelt er en prøvestørrelse på mindst 16 fluer nødvendig for at opnå pålidelige friløbsperioder for en bestemt genotype. Ved afslutningen af eksperimentet downloades rå binære data indsamlet ved hjælp af DAM-systemsoftwaren til en bærbar datalagringsenhed, for eksempel en USB-nøgle.

De rå binære data behandles ved hjælp af DAM Filescan102X og lægges sammen med 15 og 30 minutters skraldespande, når der analyseres cirkadiske parametre, eller 1 til 5 minutters skraldespande, når der analyseres slumre-/hvileparametre. I øjeblikket er fem sammenhængende minutter inaktivitet standarddefinitionen af søvn/hvile i Drosophila.