Drosophila Activity Monitor (DAM): een methode om de motorische activiteit bij vliegen te meten

- De Drosophila Activity Monitor, of DAM, bevat gecentreerde activiteitsbuizen uitgerust met vliegvoer aan de ene kant en een luchtdoorlatende dichter bij de andere. Deze opstelling biedt plaats aan enkele vliegen tijdens experimenten die meerdere dagen of zelfs weken duren.

Plaats de DAM in een gecontroleerde omgeving zoals een incubator met ingestelde temperatuur, vochtigheid en lichtcyclus. Voer het experiment uit in een donkere kamer en gebruik indien nodig een infrarood lichtbron om het apparaat te hanteren, wat, in tegenstelling tot fel licht, het circadiane systeem van de vlieg niet beïnvloedt.

Om de motorische activiteit vast te leggen, sluit u het apparaat aan op een computersysteem dat de metingen van de damdetectoren opslaat. De elektronica van de DAM detecteert continu de integriteit van een infraroodstraal die door het middelpunt van elke buis wordt uitgezonden en uploadt periodiek gegevens naar het computersysteem.

Terwijl de vlieg heen en weer loopt in de buis, kruist hij de infraroodstraal. Deze onderbrekingen worden door de DAM in de loop van de tijd geteld voor elke buis en dienen als een maat voor de vliegactiviteit.

In het volgende protocol zullen we het DAM-systeem gebruiken om circadiane ritmes bij drosophila volwassen mannen te bestuderen.

- Schakel voor het laden van vliegen in activiteitsbuizen de incubators in die worden gebruikt om de activiteitsmonitoren te huisvesten. Pas de temperatuur aan met behulp van de incubatorregelaars en stel het licht/donkerregime in met behulp van de DAM-systeemlichtregelaar of het eigen lichtregelsysteem van de incubator, volgens het gewenste experimentele ontwerp.

Verdoof vervolgens de vliegen met kooldioxide. Breng vervolgens met behulp van een fijne kwast voorzichtig een enkele vlieg over in een activiteitsbuis. Pak het midden van een enkel stuk garen dat ongeveer een halve centimeter met fijne tang is en steek het garen in het non-food uiteinde van de activiteitsbuis om de opening aan te sluiten en te voorkomen dat de vlieg tijdens het experiment ontsnapt, terwijl tegelijkertijd luchtstroom in de buis wordt mogelijk gemaakt.

Houd de buis op zijn kant totdat de vlieg ontwaakt om te voorkomen dat de vlieg vast komt te zitten aan het voedsel. Steek de buizen in de activiteitenmonitoren. Met het nieuwere, compactere model van de TriKinetics-monitoren is het noodzakelijk om de buizen op hun plaats te houden met elastiekjes om ervoor te zorgen dat de infraroodstraal de buis in de middelste positie passeert.

Plaats ten slotte de activiteitenmonitoren in de incubators en sluit ze aan op het gegevensverzamelingssysteem via de telefoondraden. Controleer met behulp van de DAM-systeemverzamelingssoftware of alle monitoren goed zijn aangesloten en of er gegevens van elk van hen worden verzameld.

Nu de vliegen in de activiteitsbuizen zijn geladen en het bewegingsbewakingssysteem klaar is, kunnen de gegevens nu worden geregistreerd. Vliegen worden gesynchroniseerd en getraind door ze bloot te stellen aan het gewenste licht / donker, of LD, en temperatuurregime gedurende twee tot vijf volle dagen. De meest gebruikte entrainmentconditie is een licht / donker cyclus van 12 uur licht / 12 uur donker bij 25 graden Celsius.

Voor de studie van circadiaanse ritmes ten opzichte van dit protocol wordt de tijd waarin de lichten in de incubator gaan gedefinieerd als tijd 0 en alle andere tijden zijn relatief ten opzichte van die waarde. Onder standaard 12:12 LD-omstandigheden vertoont het wilde type Drosophila melanogaster meestal twee periodes van activiteit; een gecentreerd rond ZT0, de ochtendpiek genoemd, en een andere rond ZT12, de term avondpiek.

Vrijlopende bewegingsritmes worden gemeten onder constante donkere en temperatuuromstandigheden na de entrainingsperiode. De instelling voor de lichtcyclus kan op elk moment in de donkere fase op de laatste dag van LD worden gewijzigd, zodat de daaropvolgende dag van het experiment de eerste dag van DD vertegenwoordigt. Zeven dagen DD-gegevensverzameling is voldoende om de circadiane periode en amplitude of sterkte van het ritme van de vliegen te berekenen.

Over het algemeen is een steekproefgrootte van ten minste 16 vliegen nodig om betrouwbare free-running periodes voor een bepaald genotype te verkrijgen. Aan het einde van het experiment worden ruwe binaire gegevens die zijn verzameld met behulp van de DAM-systeemsoftware gedownload op een draagbaar gegevensopslagapparaat, bijvoorbeeld een USB-sleutel.

De onbewerkte binaire gegevens worden verwerkt met DAM Filescan102X en samengevat in opslaglocaties van 15 en 30 minuten bij het analyseren van circadiane parameters, of 1 tot 5 minuten opslaglocaties bij het analyseren van slaap-/rustparameters. Momenteel is vijf aaneengesloten minuten inactiviteit de standaarddefinitie van slaap/rust in Drosophila.