Drosophila ( Drosophila ) Moniteur d’activité (DAM) : Méthode de mesure de l’activité locomotrice chez les mouches

- Le moniteur d’activité Drosophila, ou DAM, détient des tubes d’activité centrés équipés de nourriture pour mouches à une extrémité et d’un air perméable plus près à l’autre. Cette configuration accueille les mouches simples pendant les expériences de plusieurs jours, voire semaines.

Placez le DAM dans un environnement contrôlé comme un incubateur avec une température définie, l’humidité et le cycle de lumière. Mener l’expérience dans une pièce sombre et, si nécessaire, utiliser une source de lumière infrarouge pour manipuler l’appareil, qui, contrairement à la lumière vive, n’influence pas le système circadien de la mouche.

Pour enregistrer l’activité locomotrice, connectez l’appareil à un système informatique qui stocke les lectures des détecteurs du DAM. L’électronique du DAM détecte en permanence l’intégrité d’un faisceau infrarouge émis par le milieu de chaque tube et télécharge périodiquement des données sur le système informatique.

Au fur et à mesure que la mouche fait des allers-retours à l’intérieur du tube, elle traverse le faisceau infrarouge. Ces interruptions sont comptées par le DAM au fil du temps pour chaque tube et servent de mesure de l’activité de la mouche.

Dans le protocole suivant, nous utiliserons le système DAM pour étudier les rythmes circadiens chez les mâles adultes de Drosophila.

- Avant de charger les mouches dans des tubes d’activité, allumez les incubateurs qui seront utilisés pour loger les moniteurs d’activité. Ajustez la température à l’aide des commandes de l’incubateur et réglez le régime lumière/obscurité à l’aide du contrôleur de lumière du système DAM ou du propre système de contrôle de la lumière de l’incubateur, selon la conception expérimentale souhaitée.

Ensuite, anesthésiez les mouches avec du dioxyde de carbone. Puis, à l’aide d’un pinceau fin, transférez doucement une seule mouche dans un tube d’activité. Prenez le milieu d’un seul morceau de fil qui est d’environ un demi-pouce avec des forceps fins et insérez le fil dans l’extrémité non alimentaire du tube d’activité pour boucher l’ouverture et empêcher la mouche de s’échapper pendant l’expérience, tout en permettant le flux d’air dans le tube.

Gardez le tube posé sur le côté jusqu’à ce que la mouche se réveille pour empêcher la mouche de rester collée à la nourriture. Insérez les tubes dans les moniteurs d’activité. Avec le nouveau modèle plus compact des moniteurs TriKinetics, il est nécessaire de maintenir les tubes en place avec des élastiques pour s’assurer que le faisceau infrarouge passe le tube à la position centrale.

Enfin, placez les moniteurs d’activité dans les incubateurs et branchez-les au système de collecte de données via les fils téléphoniques. Vérifiez, à l’aide du logiciel de collecte du système DAM, que tous les moniteurs sont raccordés correctement et que les données sont collectées auprès de chacun d’eux.

Maintenant que les mouches ont été chargées dans les tubes d’activité et que le système de surveillance de l’activité locomotrice est prêt, les données peuvent maintenant être enregistrées. Les mouches sont synchronisées et entraînées en les exposant à la lumière/obscurité désirée, ou LD, et au régime de température pendant deux à cinq jours complets. L’état d’entraînement le plus couramment utilisé est un cycle lumière/obscurité de 12 heures de lumière/12 heures d’obscurité à 25 degrés Celsius.

Pour l’étude des rythmes circadiens par rapport à ce protocole, le moment où les lumières s’allument dans l’incubateur est défini comme le temps zeitgeber 0 et toutes les autres fois sont par rapport à cette valeur. Dans des conditions standard de 12:12 LD, le type sauvage Drosophila melanogaster présente généralement deux épisodes d’activité; l’un centré autour de ZT0, appelé pic matinal, et l’autre autour de ZT12, appelé pic du soir.

Les rythmes d’activité locomoteurs en libre cours d’exécution sont mesurés dans des conditions constantes d’obscurité et de température après la période d’entraînement. Le réglage du cycle lumineux peut être modifié à tout moment dans la phase sombre du dernier jour de LD, de sorte que le jour suivant de l’expérience représente le premier jour de DD. Sept jours de collecte de données DD suffisent pour calculer la période circadienne et l’amplitude ou la force du rythme des mouches.

En général, une taille d’échantillon d’au moins 16 mouches est nécessaire pour obtenir des périodes de libre fonctionnement fiables pour un génotype particulier. À la fin de l’expérience, les données binaires brutes recueillies à l’aide du logiciel DAM sont téléchargées sur un périphérique de stockage de données portable, par exemple une clé USB.

Les données binaires brutes sont traitées à l’aide de DAM Filescan102X, et résumées en bacs de 15 et 30 minutes lors de l’analyse des paramètres circadiens, ou des bacs de 1 à 5 minutes lors de l’analyse des paramètres de sommeil/repos. Actuellement, cinq minutes contiguës d’inactivité sont la définition standard du sommeil/repos à Drosophila.