Drosofilia Activity Monitor (DAM): un metodo per misurare l'attività locomotoria nelle mosche

- Drosophila Activity Monitor, o DAM, contiene tubi di attività ici dotati di fly food da un lato e un'aria permeabile più vicino all'altra. Questa configurazione ospita singole mosche durante esperimenti della durata di diversi giorni o addirittura settimane.

Posizionare il DAM in un ambiente controllato come un incubatore con temperatura, umidità e ciclo di luce impostati. Condurre l'esperimento in una stanza buia e, se necessario, utilizzare una sorgente luminosa a infrarossi per gestire il dispositivo, che a differenza della luce intensa, non influenza il sistema circadiano della mosca.

Per registrare l'attività locomotoria, collegare l'apparecchio a un sistema informatico che memorizza le letture dai rivelatori dam. L'elettronica dam rileva continuamente l'integrità di un fascio infrarosso emesso attraverso il punto medio di ogni tubo e carica periodicamente i dati sul sistema informatico.

Mentre la mosca cammina avanti e indietro all'interno del tubo, attraversa il fascio infrarosso. Queste interruzioni vengono conteggiate dal DAM nel tempo per ogni tubo e fungono da misura dell'attività di volo.

Nel seguente protocollo, useremo il sistema DAM per studiare i ritmi circadiani nei maschi adulti drosophila.

- Prima di caricare le mosche in tubi di attività, accendere gli incubatori che verranno utilizzati per ospitare i monitor di attività. Regolare la temperatura utilizzando i comandi dell'incubatore e impostare il regime luce/buio utilizzando il controller di luce del sistema DAM o il sistema di controllo della luce dell'incubatore, secondo il design sperimentale desiderato.

Quindi, anestetizzate le mosche con anidride carbonica. Quindi, utilizzando un pennello fine, trasferire delicatamente una singola mosca in un tubo di attività. Afferrare il centro di un singolo pezzo di filato che è di circa mezzo pollice con forcep sottili e inserire il filo nell&a estremità non alimentare del tubo di attività per tappare l&&;

Mantenere il tubo posato su un lato fino a quando la mosca non si sveglia per evitare che la mosca si blocchi al cibo. Inserire i tubi nei monitor di attività. Con il modello più nuovo e compatto dei monitor TriKinetics, è necessario tenere i tubi in posizione con elastici per garantire che il fascio infrarosso passi il tubo nella posizione centrale.

Infine, inserire i monitor di attività negli incubatori e collegarli al sistema di raccolta dati tramite i fili telefonici. Controllare, utilizzando il software di raccolta del sistema DAM, che tutti i monitor siano collegati correttamente e che i dati vengano raccolti da ciascuno di essi.

Ora che le mosche sono state caricate nei tubi di attività e il sistema di monitoraggio dell'attività locomotore è pronto, i dati possono ora essere registrati. Le mosche vengono sincronizzate e intrappolate esponendole alla luce/buio desiderata, o LD, e al regime di temperatura per due o cinque giorni completi. La condizione di intrappolamento più comunemente utilizzata è un ciclo chiaro/scuro di 12 ore di luce/12 ore scure a 25 gradi Celsius.

Per lo studio dei ritmi circadiani relativi a questo protocollo, il tempo in cui le luci si accese nell'incubatore è definito come tempo zeitgeber 0 e tutte le altre volte sono relative a quel valore. In condizioni standard 12:12 LD, il tipo selvaggio Drosophila melanogaster mostra tipicamente due attacchi di attività; uno incentrato su ZT0, considerato picco mattutino, e un altro intorno allo ZT12, considerato picco serale.

In generale, è necessaria una dimensione del campione di almeno 16 mosche per ottenere periodi di esecuzione libera affidabili per un particolare genotipo. Al termine dell'esperimento, i dati binari grezzi raccolti utilizzando il software di sistema DAM vengono scaricati su un dispositivo di archiviazione dati portatile, ad esempio una chiave USB.

I dati binari grezzi vengono elaborati utilizzando DAM Filescan102X e sommati in contenitori di 15 e 30 minuti quando si analizzano i parametri circadiani o bidoni da 1 a 5 minuti durante l'analisi dei parametri di sonno/riposo. Attualmente, cinque minuti contigui di inattività sono la definizione standard di sonno/riposo in Drosophila.