Drosophila Monitor de Atividade (DAM): Um método para medir a atividade locomotor em moscas

- O Monitor de Atividade de Drosophila, ou DAM, contém tubos de atividade centrados equipados com alimentos de mosca em uma extremidade e um ar permeável mais perto na outra. Esta configuração acomoda moscas únicas durante experimentos que duram vários dias ou até semanas.

Coloque a REPRESA em um ambiente controlado como uma incubadora com temperatura, umidade e ciclo de luz definidos. Conduza o experimento em uma sala escura e, se necessário, use uma fonte de luz infravermelha para manusear o dispositivo, que ao contrário da luz brilhante, não influencia o sistema circadiano da mosca.

Para registrar a atividade locomotor, conecte o aparelho a um sistema de computador que armazena as leituras dos detectores da DAM. Os eletrônicos da DAM detectam continuamente a integridade de um feixe infravermelho que é emitido através do ponto médio de cada tubo e periodicamente envia dados para o sistema do computador.

À medida que a mosca caminha para frente e para trás dentro do tubo, ela atravessa o feixe infravermelho. Essas interrupções são contadas pela DAM ao longo do tempo para cada tubo e servem como uma medida de atividade de mosca.

No protocolo a seguir, usaremos o sistema DAM para estudar ritmos circadianos em machos adultos Drosophila.

- Antes de carregar moscas em tubos de atividade, ligue as incubadoras que serão usadas para abrigar os monitores de atividade. Ajuste a temperatura usando os controles da incubadora e ajuste o regime claro/escuro usando o controlador de luz do sistema DAM ou o próprio sistema de controle de luz da incubadora, de acordo com o design experimental desejado.

Em seguida, anestesiar as moscas com dióxido de carbono. Em seguida, usando um pincel fino, transfira suavemente uma única mosca em um tubo de atividade. Pegue o meio de um único pedaço de fio que é em torno de meia polegada com fórceps finos e insira o fio na extremidade não-alimentar do tubo de atividade para tapar a abertura e impedir que a mosca escape durante o experimento, ao mesmo tempo que permite o fluxo de ar no tubo.

Mantenha o tubo colocado de lado até que a mosca acorde para evitar que a mosca fique presa ao alimento. Insira os tubos nos monitores de atividade. Com o modelo mais novo e compacto dos monitores trikinéticos, é necessário segurar os tubos no lugar com elásticos para garantir que o feixe infravermelho passe o tubo na posição central.

Por fim, coloque os monitores de atividade nas incubadoras e conecte-os ao sistema de coleta de dados através dos fios telefônicos. Verifique, usando o software de coleta do sistema DAM, que todos os monitores estão conectados corretamente, e que os dados estão sendo coletados de cada um deles.

Agora que as moscas foram carregadas nos tubos de atividade e o sistema de monitoramento de atividade locomotor está pronto, os dados agora podem ser registrados. As moscas são sincronizadas e entranizadas expondo-as à luz/escuridão desejada, ou LD, e regime de temperatura por dois a cinco dias completos.

Para o estudo de ritmos circadianos relativos a este protocolo, o tempo em que as luzes se acendem na incubadora é definido como zeitgeber time 0 e todas as outras vezes são relativos a esse valor. Sob as condições padrão 12:12 LD, o tipo selvagem Drosophila melanogaster tipicamente exibe dois ataques de atividade; um centrado em torno de ZT0, chamado pico matinal, e outro em torno de ZT12, chamado de pico noturno.

Os ritmos de atividade locomotor de corrida livre são medidos sob condições constantes de escuridão e temperatura após o período de entrada. A configuração para o ciclo de luz pode ser alterada a qualquer momento na fase escura no último dia de LD, de modo que o dia subsequente do experimento represente o primeiro dia de DD. Sete dias de coleta de dados DD é suficiente para calcular o período circadiano e amplitude ou força do ritmo das moscas.

Em geral, um tamanho amostral de pelo menos 16 moscas é necessário para obter períodos de execução livre confiáveis para um determinado genótipo. Ao final do experimento, dados binários brutos coletados usando o software do sistema DAM são baixados em um dispositivo portátil de armazenamento de dados, por exemplo, uma chave USB.

Os dados binários brutos são processados usando arquivos DAMcan102X, e somados em caixas de 15 e 30 minutos ao analisar parâmetros circadianos, ou lixeiras de 1 a 5 minutos ao analisar parâmetros de sono/descanso. Atualmente, cinco minutos contíguos de inatividade é a definição padrão de sono/descanso em Drosophila.