Drosophila Aktivite Monitörü (DAM): Sineklerde Lokomotor Aktivitesini Ölçme Yöntemi

- Drosophila Aktivite Monitörü veya DAM, bir ucunda sinek maması ve diğer ucunda hava geçirgen bir yakınlık ile donatılmış ortalanmış aktivite tüplerini tutar. Bu kurulum, birkaç gün hatta haftalar süren deneyler sırasında tek sinekleri barındırır.

DAM'ı ayarlanan sıcaklık, nem ve ışık döngüsüne sahip bir inkübatör gibi kontrollü bir ortama yerleştirin.

Lokomotor aktivitesini kaydetmek için, cihazı DAM'ın dedektörlerinden gelen okumaları depolayan bir bilgisayar sistemine bağlayın. DAM'ın elektroniği, her tüpün orta noktasından yayılan bir kızılötesi ışının bütünlüğünü sürekli olarak algılar ve periyodik olarak bilgisayar sistemine veri yükler.

Sinek tüpün içinde ileri geri yürürken kızılötesi ışını geçer. Bu kesintiler her tüp için zamanla DAM tarafından sayılır ve sinek aktivitesinin bir ölçüsü olarak hizmet eder.

Aşağıdaki protokolde, Dam sistemini Drosophila yetişkin erkeklerde sirkadiyen ritimleri incelemek için kullanacağız.

- Sinekleri aktivite tüplerine yüklemeden önce, aktivite monitörlerini barındırmak için kullanılacak inkübatörleri açın.. İstenilen deneysel tasarıma göre, inkübatör kontrollerini kullanarak sıcaklığı ayarlayın ve DAM sistemi ışık kontrol cihazını veya inkübatörün kendi ışık kontrol sistemini kullanarak ışık/karanlık rejimi ayarlayın.

Daha sonra, sinekleri karbondioksitle uyuşturun. Sonra, ince bir boya fırçası kullanarak, tek bir sineği hafifçe bir aktivite tüpüne aktarın.

Sineğin yiyeceğe yapışmasını önlemek için tüpün yan yatmasını önleyin. Tüpleri aktivite monitörlerine yerleştirin. TriKinetics monitörlerinin daha yeni, daha kompakt modeli ile kızılötesi ışının tüpü merkez konumda geçtiğinden emin olmak için tüpleri lastik bantlarla yerinde tutmak gerekir.

Son olarak, etkinlik monitörlerini inkübatörlere takın ve telefon kabloları aracılığıyla veri toplama sistemine bağlayın.

Artık sinekler aktivite tüplerine yüklendiğine ve lokomotor aktivite izleme sistemi hazır olduğuna göre, veriler artık kaydedilebilir. Sinekler, istenen ışığa /karanlığa veya LD'ye ve iki ila beş tam gün boyunca sıcaklık rejimine maruz bırakılarak senkronize edilir ve eğitilir. En sık kullanılan eğitim durumu, 25 santigrat derecede 12 saat ışık / 12 saat karanlık bir ışık / karanlık döngüsüdür.

Bu protokole göre sirkadiyen ritimlerin incelenmesi için, inkübatörde ışıkların yandığı zaman zeitgeber süresi 0 olarak tanımlanır ve diğer tüm zamanlar bu değere göredir. Standart 12:12 LD koşulları altında, vahşi tip Drosophila melanogaster tipik olarak iki aktivite zıpları sergiler; biri ZT0, sabah zirvesi olarak adlandırılan ve diğeri ZT12 etrafında, akşam zirvesi olarak adlandırılan.

Serbest çalışan lokomotor aktivite ritimleri, entraining döneminden sonra sabit karanlık ve sıcaklık koşulları altında ölçülür. Işık döngüsü ayarı, LD'nin son gününde karanlık fazda her zaman değiştirilebilir, böylece deneyin sonraki günü DD'nin ilk gününü temsil eder. Yedi günlük DD veri toplama, sirkadiyen dönemi ve sineklerin ritminin genliğini veya gücünü hesaplamak için yeterlidir.

Genel olarak, belirli bir genotip için güvenilir serbest çalışma süreleri elde etmek için en az 16 sineklik bir örnek boyutu gereklidir. Denemenin sonunda, DAM sistem yazılımı kullanılarak toplanan ham ikili veriler taşınabilir bir veri depolama cihazına, örneğin bir USB anahtarına indirilir.

Ham ikili veriler DAM Filescan102X kullanılarak işlenir ve sirkadiyen parametreleri analiz ederken 15 ve 30 dakikalık depo gözleri veya uyku/dinlenme parametrelerini analiz ederken 1 ila 5 dakikalık depo gözleri halinde toplanır. Şu anda, beş bitişik dakika hareketsizlik Drosophila'daki uyku / dinlenmenin standart tanımıdır.