Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Em moscas de Drosophilia, um estímulo visual iminente sinalizando a aproximação de um predador ativa circuitos neuronais que desencadeiam uma resposta de fuga. Para manipular o circuito neuronal que controla tal resposta, expresse uma opsina transgênica sensível à luz, como o canalrhodopsin-2 em neurônios específicos dentro desse circuito.
Channelrhodopsin é um canal de cáção sensível à foto que se abre quando exposto à luz azul brilhante. O subsequente fluxo de íons de sódio aumenta um potencial de ação que faz com que o neurônio atire e retransmita informações ao longo do circuito. Além do estímulo de luz, o cofactor all-trans-retinal é necessário para que a canalrhodopsina se abra.
Portanto, forneça toda a retina trans no alimento da mosca, uma vez que geralmente está presente em quantidades muito pequenas. Além disso, ao investigar o papel dos neurônios em um circuito neural envolvido em uma resposta a um estímulo visual, use moscas que são visualmente cegas para evitar outras respostas de luz.
Finalmente, use uma luz LED azul para desencadear o mesmo comportamento causado pelo estímulo iminente. No protocolo de exemplo, veremos a preparação de alimentos e a resposta comportamental induzida pela luz de moscas expressando canalrhodopsina em neurônios de lobo óptico.
- Comece derretendo alimentos padrão de mosca de fubá em um micro-ondas, e deixe esfriar até aquecer até tocar. Uma vez resfriado, misture 50 microliters de 20 mililitros de 20 mililitros totalmente trans-retinal em cada frasco.
Primeiro, anestesiar brevemente as moscas no gelo. Em seguida, coloque moscas individuais em pontas de pipeta P1000 com a ponta cortada para formar um diâmetro de poros de cerca de 2,25 milímetros, e sele cada extremidade com fita. Uma vez que a mosca tenha desaparecido e esteja explorando a ponta pipeta, remova a fita e coloque rapidamente a ponta na ranhura no suporte vertical.
As moscas normalmente exploram a ponta entre 30 e 60 segundos. À medida que a mosca se aproxima do topo da ponta, inicie a gravação da câmera pouco antes da mosca emergir para a plataforma. Depois que a mosca tiver surgido na plataforma, espere de um a dois segundos e, em seguida, ligue os LEDs azuis. Use um temporizador para medir manualmente o tempo até que a mosca inicie o voo.
