Vorbereitung von Drosophila Heart: Eine Technik, um die Herzphysiologie in der Erwachsenenfliege zu studieren

- Anders als bei Wirbeltieren ist das Drosophila-Herz Teil eines offenen Kreislaufsystems. Das Herz einer erwachsenen Fliege ist eine röhrenartige Struktur, die aus Kardiomyozyten gebaut ist, die durch Alary-Muskeln mit der Epidermis verbunden und in extrazelluläre Matrix eingebettet ist.

Bei Insekten dient die Hämolympium sowohl als Blut- als auch als Interstitielle Flüssigkeit, die Nährstoffe, Signalmoleküle und Immunzellen transportiert. Weitere Meilensteine des Herzens sind Ostia, die Öffnungen entlang der Röhre sind, und intrakardiale Ventile. Perikardialzellen sind entlang der Herzröhre lokalisiert und sind Teil des Ausscheidungssystems der Fliege.

In einer experimentellen Herzpräparation imitiert die künstliche Hämolymphe physiologische Bedingungen zur Erhaltung der Gewebefunktion. Obwohl die natürliche Hämolymphe nicht für den Gasaustausch verantwortlich ist, muss die künstliche Hämolymphe gut mit Sauerstoff versorgt werden, um das Fehlen eines funktionellen Trachealsystems zu ersetzen. Im folgenden Experiment zeigen wir eine halbintakte Herzpräparation von einer erwachsenen Fliege für Live-Bildgebung oder Elektrophysiologie.

- Bevor wir beginnen, bereiten wir zunächst eine künstliche Hämolympierlösung vor. Diese Lösung enthält Saccharose und Trehalose, die der künstlichen Hämolymphe aus gekühlten Stofflösungen kurz vor dem Einsatz zugesetzt werden sollten, um eine bakterielle Kontamination zu verhindern. Bringen Sie die künstliche Hämolympium auf Raumtemperatur und sauerstoffisieren Sie die Lösung durch Luftblasen für mindestens 15 Minuten.

Als nächstes ziehen Sie mehrere feine Kapillaren mit einem Standard Pipettenzieher, die für die Entfernung von Fettkörpern in der Fliege benötigt werden.

Sobald alles vorbereitet ist, müssen erwachsene Fliegen anästhetisiert werden. Dies kann mit kurzer Exposition zum Fliegen Schläfung für zwei bis fünf Minuten getan werden, aber achten Sie darauf, die Fliegen nicht im Fliegen Nickerchen länger als fünf Minuten zu verlassen. Kurzfristige Exposition gegenüber Kälte kann auch verwendet werden, um Fliegen zu beästhesieren, aber Kohlendioxid wird nicht empfohlen, da es länger anhaltende Auswirkungen auf Herzfrequenz und Rhythmizität hat.

Als nächstes Die anästhesierten Fliegen werden, dorsale Seite nach unten, in eine Petrischale gelegt, die mit einer dünnen Schicht Von Petroleumgelee überzogen ist. Die hydrophobe Nagelhaut in den Flügeln und körper sollte reversibel am Gelee kleben, aber die Fliege kann bei Bedarf neu positioniert werden.

Der Kopf, die ventrale Nervenschnur und die Beine werden mit einem einzigen Schnitt entfernt. Nach dem Schnitt wird das Präparat dann in die sauerstoffreiche künstliche Hämolymphe untergetaucht. Mit einer Federschere wird die hintere Spitze des Bauches, die aus dem Bauchsegment 7 und 8 besteht, mit einem einzigen Schnitt entfernt.

Setzen Sie die Klingen der Schere in die kleine Öffnung in der Bauchspitze ein und schneiden Sie die Nagelhaut seitlich. Dadurch wird eine Kante der ventralen Nagelhaut frei. Greifen Sie die Klappe mit Zangen und machen Sie einen ähnlichen Schnitt entlang der gegenüberliegenden Seitenkante des Bauches. Die befreite Klappe der ventralen Bauchnagelhaut kann nun entfernt werden.

Der Darm und andere Bauchorgane können in der Regel als eine einzige Masse mit Juwelieren Zange und sanftes Ziehen entfernt werden. Das Entfernen der inneren Organe zeigt das schlagende Herzrohr, das noch von kleinen Alary-Muskeln an der dorsalen Nagelhaut befestigt ist und von Fettkörpern umgeben ist. Die gezogenen Kapillaren werden in Kunststoff eingeführt, 1/16-Zoll-Schläuche an einer Vakuumquelle befestigt.

Einmal eingerichtet, wird dieses Saugsystem verwendet, um überschüssiges Fett aus der Nähe des Herzrohrs abzusaugen. Es kann auch verwendet werden, um Luftblasen zu entfernen, die sich um die Nagelhaut und alle Trümmer ansammeln. Es muss äußerste Vorsicht walten lassen, um das Herz selbst nicht zu berühren, und da der hintere Teil des Herzens sehr zerbrechlich ist, sollte diese Region ganz vermieden werden.

Bei Bedarf können die Nagelhaut und das angehängte Herz neu positioniert werden, indem die Nagelhaut vorsichtig aus dem Petroleumgelee herausgehoben und vorsichtig wieder nach unten gestampft wird. An dieser Stelle sollte die Lösung, die das Präparat badet, durch frische, künstliche Hämolymphe ersetzt werden. Dieses Präparat sollte 20 bis 30 Minuten mit Sauerstoffversorgung vor Manipulationen ausgeglichen werden dürfen. auch für elektrophysiologische Aufnahmen oder für histologische Manipulationen verwendet werden.