Forberedelse av Drosophila Heart: En teknikk for å studere hjertefysiologi i voksenfluen

- Forskjellig fra hos vertebrater, er Drosophila-hjertet en del av et åpent sirkulasjonssystem. Hjertet av en voksenflue er en rørlignende struktur bygget av kardiomyocytter som er koblet til epidermis av alary muskler og innebygd i ekstracellulær matrise. Hjertekammeret er på den bakre enden av fluen og pumper hemolymf inn i aortaen som den strømmer inn i den åpne kroppshulen.

I insekter fungerer hemolymfen som både blod og interstitiell væske, som bærer næringsstoffer, signalmolekyler og immunceller. Ytterligere landemerker i hjertet inkluderer ostia, som er åpninger langs røret, og intrakariacventiler. Perikardialceller lokaliseres langs hjerterøret og er en del av flyets ekskresjonssystem.

I et eksperimentelt hjertepreparat etterligner den kunstige hemolymfen fysiologiske forhold for å bevare vevsfunksjonen. Selv om naturlig hemolymfe ikke er ansvarlig for gassutveksling, må den kunstige hemolymfen være godt oksygenert for å erstatte mangelen på et funksjonelt trakealsystem. I det følgende eksperimentet demonstrerer vi et semi-intakt hjertepreparat fra en voksen fly for levende avbildning eller elektrofysiologi.

- Før vi begynner, forbereder vi først en kunstig hemolymfeløsning. Denne løsningen inneholder sukrose og trehalose, som skal tilsettes den kunstige hemolymfen fra nedkjølte lagerløsninger like før bruk for å forhindre bakteriell forurensning. Ta med kunstig hemolymfe til romtemperatur og oksygener løsningen ved å boble i minst 15 minutter.

Deretter trekker du flere fine kapillærer ved hjelp av en standard pipettetrekker, som vil være nødvendig for fjerning av fettlegemer i flyet.

Når alt er forberedt, må voksne fluer bedøves. Dette kan gjøres ved hjelp av kort eksponering for å fly lur i to til fem minutter, men vær forsiktig så du ikke lar fluene ligge i flue lur lenger enn fem minutter. Kortsiktig eksponering for kulde kan også brukes til bedøvelse av fluer, men karbondioksid anbefales ikke siden det har langvarige effekter på hjertefrekvens og rytmiskhet.

Deretter plasseres de bedøvede fluene, dorsal side ned, inn i en Petri parabolen belagt med et tynt lag petroleum gelé. Den hydrofobe kutiklen i vingene og kroppen skal reversibel holde seg til geléen, men flyet kan omplasseres om nødvendig. Et første kutt er laget ved hjelp av et buet par vårsaks. Dette gjøres ved å plassere saksebladene under beina på flyet og vinklet ned mot dorsaloverflaten på thoraxen nær halsen.

Hodet, ventral nerveledning og ben fjernes med et enkelt kutt. Når du er kuttet, blir preparatet deretter nedsenket i den oksygenerte kunstige hemolymfoppløsningen. Ved hjelp av vårsaks, fjernes den bakre spissen av magen, som består av buksegment 7 og 8, med et enkelt kutt. Dette gir tilgang til å lage laterale kutt langs begge kantene av magen og tjener til å kutte forbindelsen mellom bakre tarm og magesekken.

Sett saksens kniver inn i den lille åpningen i tuppen av magen og klipp kutiklet sideveis. Dette frigjør den ene kanten av ventral kutiklet. Ta tak i klaffen med tang og lag et lignende kutt langs motsatt sidekant av magen. Den frigjorte klaffen av ventral abdominal kutiklet kan nå fjernes.

Tarmen og andre bukorganer kan vanligvis fjernes som en enkelt masse ved hjelp av gullsmeder tang og mild tugging. Fjerning av de indre organene avslører det bankende hjerterøret, som fortsatt er festet til dorsal kutiklet av små alære muskler og er omgitt av fettlegemer. De trukket kapillærene settes inn i plast, 1/16-tommers rør festet til en vakuumkilde. Sugekraften er proporsjonal med spissdiameteren, så pipetter med spisser større enn 40 mikron i diameter bør ikke brukes.

Når det er satt opp, brukes dette sugesystemet til å suge av overflødig fett fra rundt hjerterøret. Det kan også brukes til å fjerne luftbobler som akkumuleres rundt kutiklet og eventuelt rusk. Ekstrem forsiktighet må tas for å unngå å berøre selve hjertet, og fordi den bakre delen av hjertet er veldig skjøre, bør den regionen unngås helt. Den voksne Drosophila hjerterøret er nå utsatt og bør slå.

Om nødvendig kan kutikylen og det vedlagte hjertet omplasseres ved å forsiktig løfte kutikylen ut av petroleumsgeléen og forsiktig temme den ned igjen, igjen unngå kontakt med hjertevevet. På dette tidspunktet bør løsningen som bader preparatet erstattes med frisk, kunstig hemolymf. Dette preparatet skal få lov til å likevekte i 20 til 30 minutter med oksygenering før noen manipulasjoner. Hvis preparatet skal opprettholdes i mer enn 60 minutter, bør det omformes med fersk kunstig hemolymfe. brukes også til elektrofysiologisk opptak eller for histologiske manipulasjoner.