Encyclopedia of Experiments: Biology
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- Para medir a vida útil média de uma população de nematoides, comece com larvas L1 sincronizadas em M9 em m9 tampão. Determine a densidade das larvas e, em seguida, adicione 50 a cada placa. Prepare pelo menos três placas de replicação por condição, bem como placas de backup.
Permita que esses vermes se desenvolvam normalmente até chegarem ao estágio L4. Agora você pode adicionar FUdR às placas, o que impedirá que os vermes produzam descendentes. Alternativamente, você precisará mover os vermes para novas placas a cada dia após a contagem, para garantir que você esteja apenas medindo a vida útil de uma única geração.
Em seguida, remova qualquer macho. Isso removerá as variáveis de sexo e acasalamento do experimento. No dia seguinte, conte o número de vermes vivos na placa procurando movimento espontâneo ou resposta ao toque suave. Remova quaisquer vermes mortos e regisque os números. Conte vermes sobreviventes diariamente até que nenhum permaneça. No protocolo de exemplo, veremos uma demonstração de um ensaio de vida.
- Carregar as placas preparadas com semeadura de bactérias com 50 animais L1 cada. Configurar as placas em uma incubadora de 20 graus Celsius até que os embriões se desenvolvam para o estágio L4. O desenvolvimento normal de L1 a L4 leva cerca de 40 horas.
Em seguida, para evitar a produção de progêneres, adicione 160 microliters de 50x FUdR a cada placa. Em seguida, remova os machos, pois a vida útil é tipicamente medida apenas com hermafroditas. Uma vez concluída, reembale as placas na incubadora de 20 graus Celsius.
Até que todos os vermes estejam mortos, marque sua viabilidade diariamente. Para isso, toque suavemente cada nematoide não em movimento na cabeça com um fio de platina ou cílios. Animais não reativos estão mortos e devem ser removidos da placa. Anotem de quaisquer anomalias durante esta rotina.
