Encyclopedia of Experiments: Biology
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- इस विच्छेदन के लिए, दो माइक्रोपिपेट का उपयोग करें: एक अंडे के रूप में लगभग समान चौड़ाई के साथ एक और एक जो दो बार चौड़ा है, और उन दोनों के बीच तेजी से हस्तांतरण की सुविधा के लिए कुओं में आयोजित समाधानों की एक श्रृंखला।
सबसे पहले, वयस्क हर्मेफ्रोडाइट्स को अंडा नमक समाधान में रखें, जो भ्रूण को फटने से रोकने के लिए ऑस्मोटिकली संतुलित है। विकासशील भ्रूणों को छोड़ने के लिए आधे में कीड़े काटें।
फिर, दो-सेल चरण भ्रूण की पहचान करें। ये कोशिकाएं निषेचित अंडाणु के विभाजन द्वारा गठित ब्लास्टोमेरेस हैं। एक भ्रूण को हाइपोक्लोराइट समाधान, ब्लीच में स्थानांतरित करने के लिए बड़े उद्घाटन के साथ माइक्रोपिपेट का उपयोग करें, जो सुरक्षात्मक अंडे के खोल को तोड़ना शुरू कर देगा।
केवल ४० से ५५ सेकंड के बाद, भ्रूण को शेल्टन के विकास माध्यम, या एसजीएम में स्थानांतरित करें । प्रत्येक भ्रूण को एसजीएम के दो कुओं में संक्षेप में धोएं ताकि उन्हें तीसरे कुएं में रखने से पहले ब्लीच के सभी निशान हटा दिए जा सकें ।
अब, छोटे माइक्रोपिपेट का उपयोग अंडे के कोयले को हटाने और ब्लास्टोमेरेस को बेनकाब करने के लिए यांत्रिक बल प्रदान करने के लिए भ्रूण को बार-बार पिपेट करने के लिए करें । धीरे से भ्रूण को अलग करने के लिए अलग-अलग ब्लास्टोमेरे कोशिकाओं को पिपेट करते रहें । निम्नलिखित प्रोटोकॉल में, हम इस तकनीक को कार्रवाई में देखेंगे ।
- दाएं और बाएं हाथ से 10 माइक्रोलीटर की क्षमता पर एक माइक्रोकैपिलरी के प्रत्येक छोर को पकड़ें। तनाव लागू करने के लिए दोनों सिरों की ओर माइक्रोकैपिलरी खींचें और दो हाथ से खींचे गए केशिकाओं को बनाने के लिए एक बर्नर के ऊपर केशिका के केंद्र को लाएं।
विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, हाथ से खींचे गए केशिकाओं के सुझावों को संदंश के साथ ट्रिम करें। दो टिप खोलने के आकार को लगभग दो बार और एक बार भ्रूण हस्तांतरण और अंडे के खोल हटाने के लिए सी एलिगेंस भ्रूण की छोटी धुरी लंबाई क्रमशः बनाएं ।
खींचे गए केशिका को मुंह में पाइपिंग उपकरण में संलग्न करें। एक बहु-अच्छी स्लाइड के कुएं पर अंडे नमक के घोल के पिपेट 45 माइक्रोलीटर।
5 से 10 वयस्क सी elegans अच्छी तरह से रखें । जल्दी सी elegans भ्रूण प्राप्त करने के लिए, टुकड़ों में वयस्कों के टुकड़ों में कटौती सी elegans शरीर के दाईं और बाईं ओर दो सुई स्थिति और एक दूसरे के पिछले सुई फिसलने ।
अच्छी तरह से अंडे नमक समाधान युक्त कुएं के बगल में एक अच्छी तरह से हाइपोक्लोराइट समाधान के पिपेट 45 माइक्रोलीटर, और बाद के तीन कुओं पर शेल्टन के विकास माध्यम के 45 माइक्रोलीटर। बड़े आकार खोलने और 40 से 55 सेकंड के लिए प्रतीक्षा करने के साथ मुंह पिपेट द्वारा हाइपोकोट समाधान में एक सेल चरण और प्रारंभिक दो-सेल चरण भ्रूण स्थानांतरित करें।
भ्रूण को अगले तीन कुओं में स्थानांतरित करके उन्हें पहले दो कुओं में से प्रत्येक में 1 से 2 सेकंड के साथ शेल्टन के विकास माध्यम में स्थानांतरित करके धोएं । एक छोटे आकार के खोलने के साथ हाथ से तैयार केशिका का उपयोग करना, ध्यान से अंडे के खोलने के लिए भ्रूण को पिपिंग दोहराएं ।
उसके बाद, दो सेल चरण भ्रूणीय ब्लास्टोमेरेस को अलग करने के लिए हाथ से तैयार केशिका के साथ लगातार पिपेट करें।
- अंडे के हानेल हटाने के बाद, फटने से रोकने के लिए ऊपर और नीचे पाइपिंग में बल को कम करें।
