C. elegans Blastomere dissectie: een methode om de eierschaal te verwijderen en embryonale cellen te dissocieren

- Gebruik voor deze dissectie twee micropipetten: een met een opening die ongeveer even breed is als een ei en een die twee keer zo breed is, en een reeks oplossingen georganiseerd in putten om een snelle overdracht tussen hen te vergemakkelijken.

Plaats eerst volwassen hermafrodieten in eizoutoplossing, die osmotisch in balans is om te voorkomen dat embryo's barsten. Snijd de wormen doormidden om de zich ontwikkelende embryo's vrij te geven.

Identificeer vervolgens embryo's in twee cellen. Deze cellen zijn de blastomeren die worden gevormd door de deling van de bevruchte eicel. Gebruik de micropipet met de grotere opening om een embryo over te brengen naar hypochlorietoplossing, bleekmiddel, dat de beschermende eierschaal begint af te breken.

Breng het embryo na slechts 40 tot 55 seconden over naar het groeimedium van Shelton, of SGM. Was elk embryo kort in twee putten van SGM om alle sporen van het bleekmiddel te verwijderen voordat u ze in een derde put plaatst.

Gebruik nu de kleinere micropipet om het embryo herhaaldelijk te pipetten en de mechanische kracht te leveren om de eierschaal te verwijderen en de blastomeren bloot te leggen. Blijf voorzichtig het embryo pipetten om de individuele blastomerecellen te scheiden. In het volgende protocol zullen we deze techniek in actie zien.

- Houd elk uiteinde van een microcapillair op een capaciteit van 10 microliter met de rechter- en linkerhand. Trek het microcapillair naar beide uiteinden om spanning aan te brengen en breng het midden van het capillair over een brander om twee met de hand getrokken haarvaten te maken.

Knip onder de ontleedmicroscoop de uiteinden van de met de hand getrokken haarvaten met een tang. Maak de twee tipopeningsgroottes ongeveer twee keer en één keer de korte aslengte van C. elegans-embryo's voor respectievelijk de embryotransfer en het verwijderen van de eierschaal.

Bevestig het getrokken capillair in een mondpijpapparaat. Pipet 45 microliter eizoutoplossing op een put van een multi-well slide.

Plaats 5 tot 10 volwassen C. elegans op de put. Om vroege C. elegans embryo's te verkrijgen, snijdt u volwassenen in stukken door twee naalden rechts en links van het lichaam van C. elegans te plaatsen en de naalden langs elkaar te schuiven.

Pipet 45 microliter hypochlorietoplossing op een put naast de put met eizoutoplossing, en pipet 45 microliter van Shelton's groeimedium op de volgende drie putten. Breng embryo's in eencellig stadium en vroeg tweecellig stadium over in de hypochorietoplossing door de mondpipet met grotere opening en wacht 40 tot 55 seconden.

Was de embryo's door ze over te brengen naar de volgende drie putten met het groeimedium van Shelton met 1 tot 2 seconden in elk van de eerste twee putten. Gebruik het met de hand getrokken capillair met een kleinere opening en herhaal voorzichtig pipetten van het embryo voor het verwijderen van de eierschaal.

Pipet daarna continu met het met de hand getrokken capillair om de tweecellige embryonale blastomeren te scheiden.

- Minimaliseer na het verwijderen van de eierschaal de kracht in het op en neer pipetten van embryo's om barsten te voorkomen.