C. elegans Dissection blastomere: Une méthode pour enlever la coquille d’œuf et dissocier les cellules embryonnaires

- Pour cette dissection, utilisez deux micropipettes : l’une avec une ouverture d’environ la même largeur qu’un œuf et l’autre deux fois plus large, et une série de solutions organisées en puits pour faciliter un transfert rapide entre eux.

Tout d’abord, placer les hermaphrodites adultes dans la solution de sel d’œuf, qui est osmotiquement équilibrée pour empêcher les embryons d’éclater. Couper les vers en deux pour libérer les embryons en développement.

Ensuite, identifiez les embryons à deux cellules. Ces cellules sont les blastomères formés par la division de l’ovule fécondé. Utilisez la micropipette avec la plus grande ouverture pour transférer un embryon à la solution hypochlorite, l’eau de Javel, qui commencera à décomposer la coquille d’œuf protectrice.

Après seulement 40 à 55 secondes, transférez l’embryon au milieu de croissance de Shelton, ou SGM. Lavez brièvement chaque embryon dans deux puits de MGF pour enlever toutes les traces de l’eau de Javel avant de les placer dans un troisième puits.

Maintenant, utilisez la micropipette plus petite pour pipette à plusieurs reprises l’embryon fournissant la force mécanique pour enlever la coquille d’œuf et exposer les blastomères. Doucement continuer à pipette l’embryon pour séparer les cellules de blastomères individuels. Dans le protocole suivant, nous verrons cette technique en action.

- Maintenez chaque extrémité d’un microcapillaire à une capacité de 10 microlitres avec la main droite et gauche. Tirez le microcapillaire vers les deux extrémités pour appliquer la tension et amener le centre du capillaire sur un brûleur pour faire deux capillaires tirés à la main.

Sous le microscope disséquant, couper les extrémités des capillaires tirés à la main avec des forceps. Faire les deux tailles d’ouverture de pointe environ deux fois et une fois la longueur d’axe courte des embryons de C. elegans pour le transfert d’embryon et l’enlèvement de coquille d’œuf, respectivement.

Attachez le capillaire tiré dans un appareil de tuyautage buccique. Pipette 45 microlitres de solution de sel d’œuf sur un puits d’une glissière multi-puits.

Placer 5 à 10 C. elegans adultes sur le puits. Pour obtenir des embryons précoces de C. elegans, coupez les adultes en morceaux en plaçant deux aiguilles à droite et à gauche du corps de C. elegans et en glissant les aiguilles les unes après les autres.

Pipette 45 microlitres de solution d’hypochlorite sur un puits à côté du puits contenant la solution de sel d’oeuf, et pipette 45 microlitres du milieu de croissance de Shelton sur les trois puits suivants. Transférer le stade d’une cellule et les embryons de stade à deux cellules tôt dans la solution d’hypochorite par la pipette de bouche avec l’ouverture de plus grande taille et attendre pendant 40 à 55 secondes.

Lavez les embryons en les transférant dans les trois puits suivant avec le milieu de croissance de Shelton avec 1 à 2 secondes dans chacun des deux premiers puits. À l’aide du capillaire dessiné à la main avec une ouverture de plus petite taille, répétez soigneusement le pipetting l’embryon pour l’enlèvement de coquille d’œuf.

Après cela, pipette en continu avec le capillaire dessiné à la main pour séparer les blastomères embryonnaires de stade à deux cellules.

- Après l’enlèvement de la coquille d’œuf, réduisez au minimum la force de pipetting embryons de haut en bas pour empêcher l’éclatement.