C. elegans Dissecção blastomere: um método para remover a casca de ovo e dissociar células embrionárias

- Para esta dissecção, utilize dois micropipettos: um com abertura aproximadamente da mesma largura de um ovo e outro que é duas vezes maior, e uma série de soluções organizadas em poços para facilitar a transferência rápida entre eles.

Primeiro, coloque hermafroditas adultas em solução de sal de ovo, que é osmoticamente equilibrada para evitar que embriões estourem. Corte os vermes ao meio para liberar os embriões em desenvolvimento.

Em seguida, identifique embriões de estágio de duas células. Essas células são os blastomeres formados pela divisão do óvulo fertilizado. Use o micropipette com a abertura maior para transferir um embrião para a solução de hipoclorito, alvejante, que começará a quebrar a casca de ovo protetora.

Após apenas 40 a 55 segundos, transfira o embrião para o meio de crescimento de Shelton, ou SGM. Lave cada embrião brevemente em dois poços de SGM para remover todos os traços do alvejante antes de colocá-los em um terceiro poço.

Agora, use a micropipette menor para in pipeta repetidamente o embrião fornecendo a força mecânica para remover a casca de ovo e expor os blastomeres. Suavemente continuar a pipeta o embrião para separar as células blastomere individuais. No protocolo a seguir, veremos esta técnica em ação.

- Segure cada extremidade de um microcapilar com capacidade de 10 microlitadores com a mão direita e esquerda. Puxe o microcapilar em direção a ambas as extremidades para aplicar tensão e traga o centro do capilar sobre um queimador para fazer dois capilares puxados à mão.

Sob o microscópio dissecando, corte as pontas dos capilares puxados à mão com fórceps. Faça as duas pontas de tamanhos de abertura aproximadamente duas vezes e uma vez o comprimento curto do eixo de C. elegans embriões para a transferência de embriões e remoção de casca de ovo, respectivamente.

Conecte o capilar puxado em um aparelho de pipetação bucal. Pipette 45 microliters de solução de sal de ovo em um poço de um slide multi-poço.

Coloque de 5 a 10 adultos C. elegans no poço. Para obter embriões C. elegans precoces, corte adultos em pedaços, posicionando duas agulhas para a direita e esquerda do corpo de C. elegans e deslizando as agulhas um pelo outro.

Pipeta 45 microliters de solução hipoclorito em um poço ao lado do poço contendo solução de sal de ovo, e pipeta 45 microliters do meio de crescimento de Shelton para os três poços subsequentes. Transfira embriões de estágio de uma célula e estágio inicial de duas células para a solução de hipochorite pela pipeta bucal com abertura de tamanho maior e espere por 40 a 55 segundos.

Lave os embriões transferindo-os para os próximos três poços com o meio de crescimento de Shelton com 1 a 2 segundos em cada um dos dois primeiros poços. Usando o capilar desenhado à mão com uma abertura de tamanho menor, repita cuidadosamente o embrião para a remoção da casca de ovo.

Depois disso, a pipeta continuamente com o capilar desenhado à mão para separar os blastomeres embrionários de duas células.

- Após a remoção da casca de ovo, minimize a força na tubulação de embriões para cima e para baixo para evitar a explosão.