К. Элеганс Бластерное вскрытие: метод удаления яичной скорлупы и диссоциации эмбриональных клеток

- Для этого вскрытия используйте два микропайетта: один с отверстием примерно такой же ширины, как яйцо и один, который в два раза шириной, и ряд решений, организованных в скважинах для облегчения быстрой передачи между ними.

Во-первых, поместите взрослых гермафродитов в раствор яичной соли, который осмотически сбалансирован, чтобы предотвратить разрыв эмбрионов.

Затем определите двухклеточные стадии эмбрионов. Эти клетки являются бластомерами, образованными делением оплодотворенной яйцеклетки. Используйте микропипет с большим отверстием для переноса эмбриона в гипохлоритный раствор, отбеливатель, который начнет ломать защитную яичную скорлупу.

После всего лишь 40 до 55 секунд, передать эмбрион в среде роста Шелтона, или SGM. Вымойте каждый эмбрион кратко в двух скважинах SGM, чтобы удалить все следы отбеливателя, прежде чем поместить их в третью скважину.

Теперь используйте меньший микропипют, чтобы повторно пипетки эмбриона, обеспечивая механическую силу для удаления яичной скорлупы и подвергать бластомеры. Аккуратно продолжать пипетки эмбриона, чтобы отделить отдельные клетки бластомера. В следующем протоколе, мы увидим этот метод в действии.

- Держите каждый конец микрокапильярии на мощность 10 микролитров правой и левой рукой. Потяните микрокапильярию к обоим концам, чтобы применить напряжение и принести центр капилляра над горелкой, чтобы сделать два ручных капилляров.

Под рассечением микроскопа, обрезать кончики ручной вытащил капилляры с типсами. Сделать два кончика размера открытия примерно в два раза и один раз короткая длина оси C. elegans эмбрионов для переноса эмбриона и удаления яичной скорлупы, соответственно.

Прикрепите вытянутый капилляр в рот трубчатый аппарат. Pipette 45 микролитров раствора яичной соли на колодец из нескольких хорошо слайд.

Поместите от 5 до 10 взрослых C. elegans на колодец. Чтобы получить ранние эмбрионы C. elegans, разрезать взрослых на куски, позиционирование двух игл справа и слева от тела C. elegans и скольжения иглы мимо друг друга.

Pipette 45 микролитров гипохлоритового раствора на скважину рядом с колодцом, содержащим раствор яичной соли, и пипетку 45 микролитров среды роста Шелтона на последующие три скважины. Передача одноклеточной стадии и ранних двухклеточных стадий эмбрионов в гипохоритный раствор ртом пипетки с большим размером открытия и ждать от 40 до 55 секунд.

Вымойте эмбрионы, передав их в ближайшие три скважины со средой роста Шелтона с 1 до 2 секунд в каждой из первых двух скважин.

После этого непрерывно пипетка с нарисованным вручную капилляром отделяет двухклеточную стадию эмбриональных бластомер.

- После удаления яичной скорлупы, свести к минимуму силу в трубопроводных эмбрионов вверх и вниз, чтобы предотвратить взрыв.