C. elegans Blastomere Diseksiyonu: Yumurta Kabuğunun Çıkarılması ve Embriyonik Hücrelerin Ayrıştırılması için Bir Yöntem

- Bu diseksiyon için iki mikropipette kullanın: biri yumurtayla yaklaşık aynı genişliğe sahip ve diğeri iki kat daha geniş ve aralarında hızlı aktarımı kolaylaştırmak için kuyularda düzenlenmiş bir dizi çözüm.

İlk olarak, yetişkin hermafroditleri embriyoların patlamasını önlemek için osmottik olarak dengelenmiş yumurta tuzu çözeltisine yerleştirin. Gelişmekte olan embriyoları serbest bırakmak için solucanları ikiye bölün.

Daha sonra, iki hücreli evre embriyoları tanımlayın. Bu hücreler döllenmiş yumurtanın bölünmesiyle oluşan blastomerlerdir. Bir embriyoyu koruyucu yumurta kabuğunun parçalanmasına başlayacak olan hipoklorit çözeltisine, çamaşır suyuna aktarmak için daha büyük açıklıklı mikropipette kullanın.

Sadece 40 ila 55 saniye sonra, embriyoyu Shelton'un büyüme ortamına veya SGM'ye aktarın.

Şimdi, yumurta kabuğunun çıkarılması ve blastomerlerin açığa çıkarılması için mekanik kuvvet sağlayan embriyoyu tekrar tekrar borulamak için daha küçük mikropipette kullanın.

- Bir mikrokapilinin her ucunun her ucunun sağ ve sol elle 10 mikrolitre kapasitede tutun. Gergi uygulamak için mikrokapilleri her iki uca doğru çekin ve iki elle çekilmiş kılcal damar yapmak için kılcal damarın merkezini bir brülörün üzerine getirin.

Diseksiyon mikroskobu altında, elle çekilen kılcal damarların uçlarını forsepsle kırpın. embriyo transferi ve yumurta kabuğu çıkarma için C. elegans embriyolarının iki uç açma boyutunu yaklaşık iki kez ve bir katı kısa eksen uzunluğunda yapın.

Çekilen kılcal damarı bir ağız pipetleme aparatına takın. Pipet 45 mikrolitre yumurta tuzu çözeltisi çok kuyulu bir kaydırak kuyusuna.

Kuyuya 5 ila 10 yetişkin C. elegan yerleştirin. Erken C. elegans embriyoları elde etmek için, C. elegans vücudunun sağına ve soluna iki iğne yerleştirerek ve iğneleri birbirlerinin yanından kaydırarak yetişkinleri parçalara ayırın.

Pipet 45 mikrolitre hipoklorit çözeltisi, yumurta tuzu çözeltisi içeren kuyunun yanındaki kuyuya ve Shelton'un büyüme ortamının pipeti 45 mikrolitresini sonraki üç kuyuya aktarın. Tek hücreli aşama ve erken iki hücreli evre embriyoları ağız pipeti ile hipokorit çözeltisine aktarın ve 40 ila 55 saniye bekleyin.

Embriyoları shelton'un büyüme ortamıyla sonraki üç kuyuya ilk iki kuyunun her birinde 1 ila 2 saniye ile aktararak yıkayın. Daha küçük boyutlu bir açıklığa sahip elle çizilmiş kılcal damarı kullanarak, yumurta kabuğunun çıkarılması için embriyoyu pipetlemeyi dikkatlice tekrarlayın.

Bundan sonra, iki hücreli evre embriyonik blastomerleri ayırmak için elle çizilmiş kılcal damar ile sürekli pipet.

- Yumurta kabuğu çıkarıldıktan sonra, patlamayı önlemek için embriyoları yukarı ve aşağı borulama kuvvetini en aza indirin.