C. elegans Blastomere Dissekering: En metod för att ta bort äggskalet och dissociera embryonala celler

- För denna dissekering, använd två mikropipetter: en med en öppning ungefär samma bredd som ett ägg och en som är dubbelt så bred, och en serie lösningar organiserade i brunnar för att underlätta snabb överföring mellan dem.

Placera först vuxna hermafroditer i äggsaltlösning, som är osmotiskt balanserad för att förhindra att embryon spricker.

Identifiera sedan embryon från två cellers stadium. Dessa celler är de blastomerer som bildas av uppdelningen av det befruktade ägget.

Efter bara 40 till 55 sekunder överför du embryot till Sheltons tillväxtmedium, eller SGM. Tvätta varje embryo kort i två brunnar SGM för att ta bort alla spår av blekmedlet innan du placerar dem i en tredje brunn.

Använd nu den mindre mikropipetten för att upprepade gånger pipettera embryot som ger den mekaniska kraften för att ta bort äggskalet och exponera blastomererna.

- Håll varje ände av ett mikrokapillär med en kapacitet på 10 mikroliter med höger och vänster hand. Dra mikrokapillären mot båda ändarna för att applicera spänning och för kapillärens centrum över en brännare för att göra två handdragna kapillärer.

Under det dissekerande mikroskopet, trimma spetsarna på de handdragna kapillärerna med tång. Gör de två spetsöppningsstorlekarna ungefär två gånger och en gånger den korta axellängden för C. elegans-embryon för embryoöverföring respektive äggskalborttagning.

Fäst den dragna kapillären i en munrörningsapparat. Pipett 45 mikroliter äggsaltlösning på en brunn i en multibrunnsrutschbana.

Placera 5 till 10 vuxna C. elegans på brunnen. För att få tidiga C. elegans embryon, skär vuxna i bitar genom att placera två nålar till höger och vänster om C. elegans kropp och skjuta nålarna förbi varandra.

Pipett 45 mikroliter hypokloritlösning på en brunn bredvid brunnen som innehåller äggsaltlösning, och pipett 45 mikroliter av Sheltons tillväxtmedium på de följande tre brunnarna. Överför encellssteg och tidiga embryon i tvåcellssteg till hypokondritlösningen vid munpipetten med större öppning och vänta i 40 till 55 sekunder.

Tvätta embryona genom att överföra dem till de kommande tre brunnarna med Sheltons tillväxtmedium med 1 till 2 sekunder i var och en av de två första brunnarna.

Därefter kontinuerligt pipett med handritad kapillär för att separera tvåcellsstadiet embryonala blastomeres.

- Efter avlägsnande av äggskal, minimera kraften i pipetting embryon upp och ner för att förhindra bristning.