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Digestão Enzimática e Dissociação Manual

 
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Digestão Enzimática e Dissociação Manual: Um Método para Preparar embriões C. elegans para cultura celular

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- Comece com ovos de pelotização que foram isolados por branqueamento de vermes adultos gravid. Certifique-se de que cada etapa deste procedimento seja conduzida estérilmente para evitar a contaminação das células cultivadas. Suspenda a pelota em uma solução de chitinase, uma enzima que quebra a quitina- um grande polissacarídeo que é um componente estrutural da casca do ovo.

Após um período de digestão adequado, centrifufique suavemente os ovos e substitua o supernascedor por meio de cultura celular para parar a digestão. Em seguida, passe os embriões através de uma agulha de calibre 18 para separar mecanicamente células individuais. Em seguida, filtrar a solução para remover detritos da casca de ovo ou aglomerados de células não forparadas. Placa as células em um prato de cultura em um deslizamento de tampa de vidro revestido com agglutinina de amendoim - uma lectina que ajuda as células a se prender ao deslizamento de cobertura por carboidratos de superfície celular vinculante.

No protocolo de exemplo, vamos preparar células embrionárias para diferenciação e análise morfológica in vitro.

- Enquanto trabalhava sob uma coifa de fluxo laminar para evitar a introdução de contaminação bacteriana, resuspenque os ovos pelotas em um mililitro de dois miligramas por quitinase mililitro e transfira-os para um tubo cônico fresco de 15 mililitros. Arrase o tubo por 10 a 30 minutos em temperatura ambiente, dependendo do frescor da enzima. Quando aproximadamente 80% das cascas de ovos forem digeridas, centrífugas os ovos a 900 g por três minutos.

Depois de remover cuidadosamente o supernascer, adicione três mililitros de meio L15. Transfira os ovos para uma placa de seis centímetros de diâmetro e inicie a dissociação manual usando uma seringa estéril de 10 mililitros com uma agulha de calibre 18. Para monitorar o grau de dissociação, coloque uma gota de suspensão em uma placa de Petri fresca e veja sob um microscópio.

Para remover aglomerados de células, ovos não digeridos e larvas eclodidas, filtrar suavemente a suspensão através de um filtro de cinco mícrons e executar um adicional de quatro a cinco mililitros de meio L15 através do filtro para recuperar as células. Para cultivar as células após centrifugar o filtrado a 900 g por três minutos, suspender as células em meio L15 completo.

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