C. elegans Saggio chemiotassi: un metodo per testare la chemiosensinazione nei vermi

- Per dare un senso alle condizioni incontrate e rispondere di conseguenza, il verme C. elegans ha, tra gli altri, un sistema chemosensorio altamente sviluppato in grado di rilevare un'ampia varietà di sostanze chimiche diverse.

I neuroni sensoriali nella testa, gli anfidi e i neuroni labiliali interni, così come i neuroni nella coda, i neuroni fasmide, sono esposti direttamente o indirettamente attraverso la cuticola alle condizioni esterne. Questi neuroni chemosensori codificano le informazioni rilevanti utilizzate dal verme per produrre una risposta comportamentale appropriata: un comportamento considerato chemiotassi.

Per testare la risposta chemiotattica a odori volatili o segnali idrosolubili gustativi, isolare i vermi dello stadio di sviluppo desiderato ed esporli alla sostanza chimica di prova su un'arena sperimentale precedentemente preparata. Quando esposti a sostanze chimiche favorevoli come quelle prodotte da una fonte alimentare batterica, C. elegans mostra chemiotassi positive verso la fonte.

In senso inverso, quando esposto a sostanze chimiche meno favorevoli o tossiche come i metalli pesanti, il verme mostra chemiotassi negative, evitando la sostanza chimica. Quindi, i mutanti olfattivi o gustativi non riescono a evitare sostanze chimiche avverse e rimangono in condizioni sfavorevoli in contrasto con gli animali di tipo selvatico che evitano le condizioni avverse.

Nel protocollo di esempio, vedremo una dimostrazione di un saggio di chemiotassi, testando l'avversione del verme al rame.

- Dopo l'incubazione notturna, rimuovere le piastre dall'incubatore e utilizzare come guida la parte inferiore marcata della piastra, pipettare 100 microlitri di rame 0,5 molare appena preparato due soluzioni solfate sul bordo dell'agar per creare una barriera esterna di rame. Pipetta 25 microlitri della soluzione di rame a due solfati per creare una barriera di mediana.

Assicurarsi che la soluzione di rame a due solfati non contatti il cerotto batterico e lasciare asciugare la soluzione di rame sulla piastra. Verificare la secchezza ogni cinque minuti dopo il trasferimento con un tessuto di laboratorio tamponando leggermente la soluzione vicino al bordo della piastra per discernere.

Immediatamente prima del test, trasferire gli organismi sperimentali su una piastra di agar priva di batteri e consentire ai nematodi di muoversi liberamente per un minuto per rimuovere i batteri in eccesso.

Successivamente, pipetta 1 millilitro di M9 sul piatto con giovani adulti che sono stati trasferiti 24 ore prima per lavare i vermi in un tubo di microcentrifugo. Centrifugare i nematodi a 3.000 volte g per un minuto.

I vermi devono formare un pellet nella parte inferiore del tubo. Aspirare la soluzione M9 senza interrompere il pellet di verme. Aggiungere 1 millilitro di soluzione M9 al pellet di verme. Invertire il tubo per mescolare i vermi con la soluzione.

Se i batteri in eccesso sono stati inizialmente trasferiti con i vermi, ripetere per un totale di cinque volte. Dopo il lavaggio finale, aspirare il supernatante fino a 100 microlitri di soluzione M9 e il pellet di verme rimane. Trasferire immediatamente i vermi dalla soluzione una volta completate le fasi di lavaggio.

Pipetta 20 microlitri del pellet di verme dal fondo del tubo sulla metà priva di batteri della piastra di dosaggio. Assicurarsi che 10 vermi vengano trasferiti nella piastra di dosaggio e che non sia presente cibo contaminante. Nessun batterio deve essere trasferito nelle piastre di gara di cibo in rame.

Rimuovere la soluzione M9 in eccesso dai nematodi con un tessuto di laboratorio entro un minuto. Assicurarsi che la soluzione M9 non contatti con la soluzione di solfato due di rame e che i vermi e la superficie dell'agar rimangano intatti. Scartare i vermi che sono stati accidentalmente rimossi con il tessuto di laboratorio.

Una volta rimossa la soluzione M9 e tutti i vermi hanno iniziato modelli locomotori non liquidi, cioè quando hanno smesso di trashing, avviare il cronometro di dosaggio. Se i vermi extra sono stati accidentalmente inclusi, rimuoverli raccogliendo con olio di alocarbonio per assicurarsi che non vengano aggiunti batteri alla piastra.

Controllare le piastre di dosaggio ogni 30 minuti. Per le piastre di dosaggio con macchie batteriche, segnare positivamente gli organismi se hanno raggiunto la macchia alimentare per un periodo di quattro ore. Per le piastre di controllo negative, segnare positivamente gli organismi se hanno superato la barriera.