C. elegans Ensaio de Quimioterapia: Um método para testar a quimioensation em worms

- Para dar sentido às condições encontradas e responder a elas de acordo, o verme C. elegans tem, entre outros, um sistema de quimioensory altamente desenvolvido capaz de detectar uma grande variedade de diferentes produtos químicos.

Os neurônios sensoriais na cabeça, os neurônios labiais anfóides e internos, bem como os neurônios na cauda, os neurônios phasmid, são expostos direta ou indiretamente através da cutícula às condições externas.

Para testar a resposta chemotactic a odores voláteis ou sinais solúveis em água gustativo, isolar vermes do estágio de desenvolvimento desejado e expô-los ao produto químico de teste em uma arena experimental previamente preparada. Quando expostos a produtos químicos favoráveis como os produzidos por uma fonte de alimento bacteriana, C. elegans exibe quimiotaxis positivos em direção à fonte.

Reverso, quando exposto a produtos químicos menos favoráveis ou tóxicos como metais pesados, o verme exibe quimotaxis negativos, evitando o produto químico. Portanto, mutantes olfativos ou gustativos não conseguem evitar produtos químicos aversivos e permanecem em condições desfavoráveis em contraste com animais do tipo selvagem que evitam a condição aversiva.

No protocolo de exemplo, veremos uma demonstração de um ensaio de quimiotaxis, testando a aversão do verme ao cobre.

- Após a incubação durante a noite, remova as placas da incubadora e use a parte inferior marcada da placa como guia, pipeta 100 microliters de cobre recém-preparado 0,5 molar solução de dois sulfato na borda do ágar para criar uma barreira de cobre exterior.

Certifique-se de que a solução de sulfato de cobre dois não entre em contato com a mancha bacteriana e permita que a solução de cobre seque na placa. Verifique se há secura a cada cinco minutos após a transferência com um tecido de laboratório, cortando levemente a solução perto da borda da placa para discernir.

Imediatamente antes do ensaio, transfira os organismos experimentais para uma placa de ágar livre de bactérias e permita que os nematoides se movam livremente por um minuto para remover o excesso de bactérias.

Em seguida, pipeta 1 mililitro de M9 na placa com adultos jovens que foram transferidos 24 horas anteriormente, a fim de lavar vermes em um tubo de microcentrifuge. Centrífuga os nematoides a 3.000 vezes g por um minuto.

Os vermes devem formar uma pelota na parte inferior do tubo. Solução Aspirada M9 sem interromper a pelota de minhoca. Adicione 1 mililitro de solução M9 à pelota de minhoca. Tubo de inverter para misturar vermes com a solução.

Se o excesso de bactérias for inicialmente transferido com os vermes, repita por um total de cinco vezes. Após a lavagem final, aspire o supernatante até 100 microliters de solução M9 e a pelota de verme permanece.

Pipeta 20 microliters da pelota de verme do fundo do tubo para a metade livre de bactérias da placa de ensaio. Certifique-se de que 10 vermes são transferidos para a placa de ensaio e que não está presente nenhum alimento contaminante.

Remova a solução M9 em excesso dos nematoides com um tecido de laboratório dentro de um minuto. Certifique-se de que a solução M9 não entre em contato com a solução de dois sulfatos de cobre, e que os vermes e a superfície do ágar permaneçam intactos. Descarte vermes que foram acidentalmente removidos com o tecido de laboratório.

Uma vez que a solução M9 tenha sido removida e todos os worms tenham iniciado padrões locomotores não líquidos, ou seja, quando eles pararam de bater, inicie o cronômetro de ensaio. Se vermes extras foram acidentalmente incluídos, remova-os escolhendo com óleo de halocarbono para garantir que nenhuma bactéria seja adicionada à placa.

Verifique as placas de ensaio a cada 30 minutos. Para as placas de ensaio com manchas bacterianas, escore positivamente os organismos se eles atingirem o patch alimentar durante um período de quatro horas. Para as placas de controle negativas, escore positivamente os organismos se eles cruzaram a barreira.