C. elegans Kemotaksi Testi: Solucanlarda Kemosentasyonu Test Etmek İçin Bir Yöntem

- Karşılaşılan koşulları anlamlandırmak ve bunlara uygun şekilde yanıt vermek için, solucan C. elegans, diğerlerinin yanı sıra, çok çeşitli farklı kimyasalları tespit edebilen son derece gelişmiş bir kemosentez sistemine sahiptir.

Kafadaki duyusal nöronlar, amfiid ve iç labial nöronların yanı sıra kuyruktaki nöronlar, fazsmid nöronlar, manikül yoluyla doğrudan veya dolaylı olarak dış koşullara maruz kalır. Bu kemosentezör nöronlar, solucan tarafından uygun bir davranışsal yanıt üretmek için kullanılan ilgili bilgileri kodlar: kemotaxis olarak adlandırılan bir davranış.

Uçucu kokulara veya gustatory suda çözünen ipuçlarına kemotaktik yanıtı test etmek için, istenen gelişim aşamasının solucanlarını izole edin ve daha önce hazırlanmış deneysel bir arenada test kimyasallarına maruz kalın. Bakteriyel bir besin kaynağı tarafından üretilenler gibi olumlu kimyasallara maruz kaldıklarında, C. elegans kaynağa doğru pozitif kemotaksi gösterir.

Tersine, ağır metaller gibi daha az elverişli veya toksik kimyasallara maruz kaldığında, solucan negatif kemotaksi görüntüler, kimyasaldan kaçınır. Bu nedenle, koku alma veya gustatory mutantlar, aversif kimyasallardan kaçınamaz ve aversif durumdan kaçınan vahşi tip hayvanların aksine elverişsiz koşullarda kalırlar.

Örnek protokolde, solucanın bakırdan nefretini test eden bir kemotaksi testi gösterisi göreceğiz.

- Bir gecede inkübasyondan sonra, plakaları inkübatörden çıkarın ve plakanın işaretli alt kısmını kılavuz olarak kullanarak, pipet 100 mikrolitre taze hazırlanmış 0,5 molar bakır iki sülfat çözeltisi agar kenarında dış bakır bariyer oluşturmak için. Pipet 25 mikrolitre bakır iki sülfat çözeltisi orta hat bariyeri oluşturmak için.

Bakır iki sülfat çözeltisinin bakteri yaması ile temas etmediğinden ve bakır çözeltinin plakaya kurumasını sağladığından emin olun.

Testten hemen önce, deneysel organizmaları bakteri içermeyen bir agar plakasına aktarın ve nematodların fazla bakterileri gidermek için bir dakika boyunca serbestçe hareket etmesine izin verin.

Daha sonra, pipet 1 mililitre M9 solucanları bir mikrosantrifüj tüpüne yıkamak için 24 saat önce aktarılan genç yetişkinlerle plakaya.

Solucanlar tüpün dibinde bir pelet oluşturmalıdır. Solucan peletini bozmadan M9 çözeltisini aspire edin. Solucan peletine 1 mililitre M9 çözeltisi ekleyin. Solucanları çözelti ile karıştırmak için tüpü ters çevirin.

Aşırı bakteriler başlangıçta solucanlarla transfer edildiyse, toplam beş kez tekrarlayın. Son yıkamadan sonra, 100 mikrolitre M9 çözeltisi ve solucan peleti kalana kadar süpernatantı aspire edin. Yıkama adımları tamamlandıktan sonra solucanları derhal çözeltiden aktarın.

Pipet 20 mikrolitresi tüpün dibinden test plakasının bakteri içermeyen yarısına. 10 solucanın test plakasına aktarıldığından ve kirletici gıda bulunmadığından emin olun. Bakır gıda yarış plakalarına bakteri transfer edilmesin.

Nematodlardaki fazla M9 çözeltisini bir dakika içinde bir laboratuvar dokusuyla çıkarın. M9 çözeltisinin bakır iki sülfat çözeltisine temas etmediğinden ve solucanların ve agar yüzeyinin bozulmadan kaldığından emin olun. Yanlışlıkla laboratuvar dokusuyla birlikte çıkarılan solucanları atın.

M9 çözeltisi çıkarıldıktan ve tüm solucanlar sıvı olmayan lokomotor desenlerine başladıktan sonra, yani darp etmeyi bıraktıklarında, test kronometresini başlatın. Ekstra solucanlar yanlışlıkla dahil edildiyse, plakaya bakteri eklenmediğinden emin olmak için halokarbon yağı ile toplayarak çıkarın.

Her 30 dakikada bir test plakalarını kontrol edin. Bakteri yaması olan test plakaları için, dört saatlik bir süre içinde gıda bandına ulaştılarsa organizmaları olumlu puanlayın. Negatif kontrol plakaları için, bariyeri geçtilerse organizmaları olumlu puanlayın.