C. elegans Bewegungsverfolgung: Eine Methode zur Bewertung der Fortbewegung in Worms

- Um die Fortbewegung in C. elegans zu bewerten, verwenden Sie eine Kamera, um die Bewegung der Würmer auf einer Agarplatte aufzuzeichnen und eine gleichmäßige Ausleuchtung der Platte während der Aufnahme zu gewährleisten. Um die Bewegung der Würmer um die Platte zu beschränken, verwenden Sie Kupferringe. Kupfer ist aversiv zu C. elegans, so dass Würmer innerhalb der Ringe korriert werden.

Legen Sie mehrere Kupferringe auf eine Platte, um gleichzeitig Würmer in jedem Ring zu verfolgen. Dies ermöglicht die Beurteilung von Kontroll- und Versuchstieren unter identischen Bedingungen, wodurch die tägliche Variabilität reduziert wird und nebeneinander Vergleiche möglich sind. Zeichnen Sie die Bewegung der Würmer über festgelegte Zeitintervalle auf und verwenden Sie Computersoftware, um Merkmale des Lokomotivverhaltens wie die Geschwindigkeit der Bewegung und die zurückgelegte Entfernung zu analysieren.

Im Beispielprotokoll werden wir eine Demonstration eines Bewegungsverfolgungstests sehen, der die Auswirkungen von Alkohol auf die Fortbewegungsgeschwindigkeit des Wurms testet.

- Zu Beginn, Nehmen Sie sich zwei Minuten oder weniger, um 10 Würmer von jeder Versuchsgruppe in die Mitte eines Kupferrings auf einer Akklimatisierungsplatte zu übertragen. Dies ist eine Platte ohne Ethanol. Vermeiden Sie die Übertragung von Nahrung mit den Würmern, da es ihre Bewegung reduziert. Vermeiden Sie es auch, die Agaroberfläche zu beschädigen, weil die Würmer graben. Zeichnen Sie die Zeit der Belastung auf die Platte, und achten Sie darauf, die Übertragung von Würmern auf jede Platte um mehr als zwei Minuten zu staffeln, so dass jede Platte einzeln gefilmt werden kann.

Lassen Sie jede Akklimatisierungsplatte 30 Minuten bei Raumtemperatur brüten. Dann übertragen Sie die Würmer auf die Assayplatte, nach der Reihenfolge, in der die Würmer auf die Akklimatisierungsplatte gestellt werden. Mit einem dünnkantigen abgeflachten Wurmpick ohne Bakterien, sammeln Sie die Würmer auf der Oberseite der abgeflachten Pickmittierbewegung mit einer Schaufelbewegung. Versiegeln Sie dann die Platte mit Laborfilm, um den Verlust von Ethanol zu minimieren.

- Die Geschwindigkeit, mit der die Tiere in diesem Schritt übertragen werden, ist sehr wichtig, da die übertragenen Tiere länger Ethanol ausgesetzt werden. So ist es eine gute Idee zu drehen, welche Stämme zuerst über experimentelle Replikationen auf die Platte gelegt werden.

- Ein Mikroskop mit hochauflösender Videokamera ist erforderlich, um die Würmer jetzt zu filmen. Selbst die Beleuchtung, z. B. von einer drei Zoll großen quadratischen Hintergrundbeleuchtung, ist für die Analyse unerlässlich. Um den Kontrast zu erhalten, bilde die Plattenmedienseite nach oben.

Bereiten Sie die Bildanalyse-Software vor, um 120 Frame-, 12-Bit-, Graustufen- und Zeitrafferfilme in einem Frame pro Sekunde zu erfassen. Um die Größe der Ausgabedatei zu reduzieren, während immer noch eine ausreichende Bildauflösung beibehalten wird, verwenden Sie einen Zwei-mal-zwei-Binning-Modus.

Nehmen Sie nun zweiminütige Filme von jeder Platte auf, 10 Minuten nachdem die letzten Würmer auf diese Platte gelegt wurden. Dann machen Sie eine zweite zweiminütige Aufnahme, 30 Minuten, nachdem Würmer auf die Platte gelegt wurden. Für diese Demonstration wird Image-Pro Plus Software verwendet, da eine Vielzahl anderer Software an die Technik angepasst werden kann. Analysieren Sie die Filme als Zwei-Minuten-Segmente.

Wenden Sie zuerst einen Filter auf die Bilder an, der den Hintergrund flacht und den Kontrast der Wurmobjekte erhöht. Wählen Sie im Menü Prozess, dann Filter, dann Verbesserung und dann Flatten aus. Legen Sie den Parameter für einen dunklen Hintergrund und eine 20-Pixel-Featurebreite fest.

Analysieren Sie nun die Fortbewegung der Tiere in jedem Ring separat mit einem kreisförmigen Bereich von Interesse, der den Kupferring überlappt. Identifizieren und verfolgen Sie die Würmer mit dem Befehl Track Objects unter dem Untermenü Messen.

Verwenden Sie im Fenster Tracking-Datentabelle die Schaltfläche Tracking-Optionen, um bestimmte Spuren auszuschließen und experimentelle Artefakte einzuschränken. Legen Sie unter der Registerkarte Auto-Tracking die Spurparameter auf eine Geschwindigkeitsgrenze von 400 Mikrometern pro Frame fest. Stellen Sie die Beschleunigungsgrenze auf Automatisch ein.

Legen Sie die minimale Gesamtspurlänge auf 400 Mikrometer fest, und legen Sie den vorherrschenden Bewegungstyp auf Chaotisch fest. Legen Sie dann unter dem Track-Parameter die Objekte so fest, dass Partielle Spuren eine Mindestlänge von 21 Frames haben und eine Tracking-Projektionstiefe von einem Frame haben.

Um nun den Tracking-Prozess zu initiieren, klicken Sie zuerst auf die Schaltfläche Alle Spuren automatisch. Dies führt zum Dialogfeld Zähl-/Größenoptionen und zum Tracking-Dialog. Wählen Sie im Dialogfeld Anzahl/Größe die Option Manuell für die Intensitätsbereichsauswahl aus. Dies bietet einen wichtigen Schwellenwertschritt. Passt dann die Schieberegler Intensitätsschwelle an, um einen inklusiven Bereich zu erstellen, der dunkle Objekte hervorhebt.

Wenden Sie nun einen Größenfilter an, um Objekte auszuschließen, die größer oder kleiner als ein einzelner Wurm sind. Gehen Sie zum Menü Messen, und wählen Sie dann das Dialogfeld Anzahl/Größe.Hier stellen Sie den Flächenbereich auf 28.000 bis 120.000 Quadratmikron ein. Und stellen Sie den Umfangsbereich auf 600 bis 2.500 Mikrometer ein. Nehmen Sie Anpassungen an diesen Parametern vor, wenn Sie Würmer von ungewöhnlicher Größe verwenden.

Beenden Sie nun den Tracking-Prozess, indem Sie im Dialogfeld "Weiter" klicken. Überprüfen Sie bitte, ob die Ausgabe mit dem Filmmaterial verfolgt wird. Stellen Sie sicher, dass jeder Wurm dargestellt wird, es sei denn, es gibt einen klaren Grund, ihn zu filtern.

Als Nächstes berechnen Sie die Geschwindigkeit jedes Wurms, indem Sie die zurückgelegte Entfernung zwischen jedem Frame oder jeder Sekunde durchschnittlich berechnen, und erstellen Sie eine durchschnittliche Geschwindigkeit für die Spuren in jeder Grundgesamtheit. Betrachten Sie diesen endgültigen Durchschnitt als einen Beispielpunkt für die statistische Analyse des Experiments.