कैल्शियम इमेजिंग: लाइव सी एलिगेंस में तंत्रिका गतिविधि की कल्पना करने के लिए एक विधि

- जीसीएएमपी को व्यक्त करने वाला एक ट्रांसजेनिक वर्म रखें-- एक कैल्शियम सेंसिंग प्रोटीन-- कृमि के लिए बैक्टीरियल भोजन के साथ-साथ एक इमेजिंग कक्ष में। फिर वाष्पीकरण को रोकने के लिए ढक्कन और प्रयोगशाला फिल्म के साथ पकवान को सील करें। इसे व्यापक क्षेत्र के लिए सुसज्जित एक यौगिक माइक्रोस्कोप के नीचे देखें। इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके उनके व्यवहार को ट्रैक करने और फ्लोरोरेसेंस को कैप्चर करने के लिए कीड़े की रिकॉर्ड समय चूक छवियां।

ट्रांसजेनिक कीड़े एक प्रमोटर के नियंत्रण में एक GCaMP सेंसर प्रोटीन व्यक्त करते हैं जो एक विशिष्ट न्यूरॉन में GCaMP अभिव्यक्ति को चलाता है। जब वह न्यूरॉन सक्रिय हो जाता है, तो यह एक क्रिया क्षमता को आग लगाता है, जो प्लाज्मा झिल्ली को विकृत कर देता है। ध्रुवीकरण होने पर, वोल्टेज-गेटेड कैल्शियम चैनल प्लाज्मा झिल्ली में खुलते हैं । इससे कोशिका में कैल्शियम आयनों का प्रवाह होता है, जिसके परिणामस्वरूप न्यूरोनल एक्सेप्टेशन होता है ।

उत्तेजित न्यूरॉन में GCaMP कैल्शियम आयनों को बांधता है। यह GCaMP को फ्लोरेसेस का कारण बनता है जब कीड़े को कम तीव्रता वाले फ्लोरेसेंस एक्सटिटेशन लाइट के साथ चित्रित किया जाता है। उदाहरण प्रोटोकॉल में, हम एगरॉर्जेड माइक्रोचेम्बर्स में ट्रांसजेनिक सी एलिगेंस में एवा इंटरन्यूरॉन गतिविधि की कल्पना करने के लिए कैल्शियम इमेजिंग का उपयोग करेंगे।

- कैल्शियम इमेजिंग एक यौगिक माइक्रोस्कोप पर किया जाता है जो व्यापक क्षेत्र epifluorescence के लिए सुसज्जित है। प्रकाश जोखिम को सीमित करने के लिए, ट्रांजिस्टर-ट्रांजिस्टर तर्क संकेत का उपयोग करें जो एक ही समय में नमूना को रोशन करने के लिए एलईडी को ट्रिगर करता है कैमरा एक फ्रेम रिकॉर्ड करता है।

हर 15 से 30 मिनट में प्रत्येक कीड़ा को चित्रित करने वाली 24 घंटे तक एक फट फिल्म चलाएं। पहले, डीआईसी के साथ 20 सेकंड रिकॉर्ड करें, फिर जीएफपी फ्लोरेसेंस के साथ 20 सेकंड, और अंत में, नियंत्रण अभिव्यक्ति के स्तर के लिए mKate2 संकेत की एक छवि।

दृश्य डेटा निरीक्षण के लिए, फ्लोरेसेंस तीव्रता में छोटे परिवर्तनों की दृश्यता को बढ़ाने के लिए एक झूठे रंग मानचित्र का उपयोग करें। अंत में, मानक प्रक्रियाओं का उपयोग करके कैल्शियम डेटा विश्लेषण करें।