Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Поместите один трансгенный червь, выражаюющий GCaMP - белок кальция зондирования - в камеру визуализации вместе с бактериальной пищей для червя. Затем печать блюдо с крышкой и лабораторной пленкой, чтобы предотвратить испарение. Просмотр его под соединение микроскопом оборудованы для широкого поля эпифлюоресценции. Запись промежуток времени изображения червей для отслеживания их поведения и захвата флуоресценции с помощью программного обеспечения изображений.
Трансгенные черви выражают белок датчика GCaMP под контролем промоутера, который управляет экспрессией GCaMP в определенном нейроне. Когда этот нейрон активируется, он запускает потенциал действия, который деполяризирует плазменную мембрану. После деполяризации, закрытые напряжением кальциевые каналы открываются в плазменной мембране.
GCaMP в возбужденном нейроне связывает ионы кальция. Это приводит к тому, что GCaMP флуоресцентно, когда черви изображены с низкой интенсивностью флуоресцентного возбудительного света. В примере протокола мы будем использовать визуализацию кальция для визуализации интернейронной активности AVA в трансгенных C. elegans в микрошамерах агарозы.
- Кальций изображения выполняется на соединение микроскопа, оборудованного для широкого поля эпифлуоресценции. Чтобы ограничить воздействие света, использовать транзистор-транзисторный логический сигнал, который вызывает светодиод для освещения образца в то же время камера записывает кадр.
Запустите фильм взрыва в течение 24 часов, что изображения каждого червя каждые 15 до 30 минут. Во-первых, запись 20 секунд с DIC, затем 20 секунд с флуоресценцией GFP, и, наконец, изображение сигнала mKate2 для уровня экспрессии контроля.
Для визуального анализа данных используйте ложную цветную карту для повышения видимости небольших изменений интенсивности флуоресценции.
