Imaging calcio: un metodo per visualizzare l'attività neurale in C. elegans dal vivo

- Posizionare un verme transgenico che esprime GCaMP, una proteina per il rilevamento del calcio, in una camera di imaging insieme al cibo batterico per il verme. Quindi sigillare il piatto con il coperchio e la pellicola di laboratorio per prevenire l'evaporazione. Visualizzarlo al microscopio composto attrezzato per l'epifluorescenza a campo largo. Registrare le immagini time lapse dei vermi per monitorarne il comportamento e catturare la fluorescenza utilizzando il software di imaging.

I vermi transgenici esprimono una proteina del sensore GCaMP sotto il controllo di un promotore che guida l'espressione GCaMP in un neurone specifico. Quando quel neurone viene attivato, attiva un potenziale di azione, che depolarizza la membrana plasmatica. Dopo la de-polarizzazione, i canali di calcio gated di tensione si aprono nella membrana plasmatica. Ciò causa un afflusso di ioni di calcio nella cellula, con conseguente eccitazione neuronale.

GCaMP nel neurone eccitato lega gli ioni di calcio. Questo fa sì che GCaMP si fluoresce quando i vermi sono immagini con una luce di eccitazione a fluorescenza a bassa intensità. Nel protocollo di esempio, useremo l'imaging di calcio per visualizzare l'attività internauron AVA in C. elegans transgenici in microcamere di agarosio.

- L'imaging del calcio viene eseguito su un microscopio composto attrezzato per l'epifluorescenza ad ampio campo. Per limitare l'esposizione alla luce, utilizzare un segnale logico transistor-transistor che attiva un LED per illuminare il campione contemporaneamente alla fotocamera registra un fotogramma.

Eseguire un filmato burst per 24 ore che immagini ogni worm ogni 15-30 minuti. In primo luogo, registrare 20 secondi con DIC, quindi 20 secondi con fluorescenza GFP e, infine, un'immagine del segnale mKate2 per i livelli di espressione di controllo.

Per l'ispezione dei dati visivi, utilizzare una falsa mappa dei colori per migliorare la visibilità di piccole variazioni nell'intensità della fluorescenza. Infine, eseguire l'analisi dei dati del calcio utilizzando procedure standard.