Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Plasser en transgen orm som uttrykker GCaMP - et kalsiumsenkende protein - i et bildekammer sammen med bakteriell mat til ormen. Forsegle deretter parabolen med lokket og laboratoriefilmen for å forhindre fordampning. Se det under et sammensatt mikroskop utstyrt for bredfelts epifluorescens. Registrer tidsforløpbilder av ormene for å spore deres oppførsel og fange fluorescens ved hjelp av bildebehandlingsprogramvare.
Transgene ormer uttrykker et GCaMP-sensorprotein under kontroll av en promotor som driver GCaMP-uttrykk i en bestemt nevron. Når den nevronen aktiveres, avfyrer den et handlingspotensial, som depolariserer plasmamembranen. Ved de-polarisering åpner spenningsportede kalsiumkanaler i plasmamembranen. Dette forårsaker en tilstrømning av kalsiumioner i cellen, noe som resulterer i nevronal eksitasjon.
GCaMP i den begeistrede nevronen binder kalsiumionene. Dette får GCaMP til å fluoresce når ormene er avbildet med et fluorescenseksitasjonslys med lav intensitet. I eksempelprotokollen vil vi bruke kalsiumavbildning for å visualisere AVA internuronaktivitet i transgene C. elegans i agarose mikrochambers.
- Kalsiumavbildning utføres på et sammensatt mikroskop utstyrt for epifluorescens i bredt felt. For å begrense lyseksponering, bruk et transistortransistor logikksignal som utløser en LED for å belyse prøven samtidig som kameraet registrerer et bilde.
Kjør en burst-film i 24 timer som bilder hver orm hvert 15 til 30 minutt. Først registrerer du 20 sekunder med DIC, deretter 20 sekunder med GFP-fluorescens, og til slutt et bilde av mKate2-signalet for kontrolluttrykksnivåer.
For visuell datainspeksjon, bruk et falskt fargekart for å forbedre synligheten av små endringer i fluorescensintensiteten. Til slutt, utfør kalsiumdataanalyse ved hjelp av standardprosedyrer.
