Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Breng om te beginnen jongvolwassen wormen over op een vers agarosepad op een glijbaan. Voeg vervolgens een paar druppels 12 millimolar levamisole-oplossing toe om de wormen te verlammen. Bedek de wormen met een deklip en wacht een paar minuten. Plaats de dia onder een draaiende schijfconocale microscoop en concentreer je op het laterale buitenste oppervlak van de worm.
De epidermis van een volwassen worm is een dunne eenlaagse structuur bestaande uit multi-nucleated syncytia die het gevolg zijn van celfusiegebeurtenissen. Het apicale oppervlak van epidermis scheidt een flexibele collageenachtige cuticula af, terwijl het basale oppervlak wordt bedekt door een dunne laag extracellulaire matrix genaamd de basale lamina.
Wond vervolgens het apicale oppervlak van de opperhuid met een laser. Cytoplasma van de beschadigde cellen kan uitlekken en verschijnen als een bel op de wondplaats.
Laserbestraling heeft een voordeel ten opzichte van andere technieken, zoals naaldwonden, omdat het gelokaliseerde verstoring van de nagelriem en epidermale cellen veroorzaakt, zonder interne weefsels te beschadigen. In het voorbeeldprotocol zullen we het proces van laserwonden in C. elegans zien.
- Om de nematoden nauwkeurig te verwonden, maakt dit protocol gebruik van een femtoseconde laser die is bevestigd aan de confocale microscoop van de draaiende schijf. Lijn- of puntscans met femtoseconde-lasers, zoals die in tweefotonenmicroscopen, moeten ook volstaan.
- Begin met het verzamelen van 10 jongvolwassenen op een agarpad. Verlam ze in een druppel van twee microliter van 12 millimolar levamisole-oplossing. Bedek ze vervolgens met een afdeklip en wacht een paar minuten terwijl ze verlammen.
- Het is essentieel dat een dier volledig verlamd is. 12 millimolar levamisole heeft geen invloed op de wondrespons. Er kunnen echter ook andere methoden van immobilisatie worden gebruikt.
- Zorg ervoor dat het femtoseconde laservermogen is ingesteld op 140 milliwatt, zoals gemeten vóór het doel, en de laserherhalingssnelheid is 80 megahertz. Lokaliseer nu de wormen onder een draaiende schijfconocale microscoop. Met behulp van een 100x-objectief met een hoog numeriek diafragma, richt u zich op de laterale voorste of achterste syncytiële epidermis van de doelworm.
Focus op het apicale oppervlak van de epidermale cel, schijn de laser gedurende twee pulsen van 200 milliseconden gescheiden door 20 milliseconden. Dit moet voldoende zijn om de epidermis te verwonden. Wacht even en observeer de lokale verstoring van cytoplasma, die zal verschijnen als borrelend. Als er een fluorescerende marker aanwezig is, kan gelokaliseerd bleken worden waargenomen.
