Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Til å begynne med, overfør unge voksne ormer til en frisk agarosepute på et lysbilde. Legg deretter til noen dråper 12 millimolar levamisole-løsning for å lamme ormene. Dekk ormene med alip og vent noen minutter. Plasser lysbildet under et spinnende disk konfokalt mikroskop og fokuser på den laterale ytre overflaten av ormen.
Epidermis av en voksen orm er en tynn enkeltlagsstruktur som består av multi-nukleert synytia som følge av cellefusjonshendelser. Den apikale overflaten av epidermis skiller ut en fleksibel kollagenaktig kutikula, mens basaloverflaten er dekket av et tynt lag med ekstracellulær matrise kalt basal lamina.
Deretter sårer den apikale overflaten av epidermis med en laser. Cytoplasma fra de skadede cellene kan lekke ut, vises som en boble på sårstedet.
Laserbestråling har en fordel i forhold til andre teknikker, for eksempel nålesår, da det forårsaker lokalisert forstyrrelse av kutiklene og epidermale celler, uten å skade indre vev. I eksempelprotokollen vil vi se prosessen med lasersår i C. elegans.
- For å såre nematodene nøyaktig, bruker denne protokollen en femtosecond laser festet til spinnende disk confocal mikroskop. Linje- eller punktskanninger ved hjelp av femtosecond lasere, for eksempel de i to-fotonmikroskop, bør også være tilstrekkelig.
- Begynn med å samle 10 unge voksne på en agarpute. Lamme dem i en to mikroliterdråpe på 12 millimolar levamisolløsning. Dekk dem deretter med en dekselslipp og vent noen minutter mens de lammer.
- Det er viktig at et dyr er helt lammet. 12 millimolar levamisol vil ikke påvirke sårresponsen.
- Sørg for at femtosecond laserkraften er satt til 140 milliwatt, målt før målet, og laserrepetisjonshastigheten er på 80 megahertz. Nå, finn ormene under en spinnende disk konfokalt mikroskop. Ved hjelp av en 100x mål med en høy numerisk blenderåpning, fokuser på lateral fremre fremre eller bakre synkopsytial epidermis av målormen.
Fokuser på den apikale overflaten av epidermalcellen, skinn laseren i to 200 millisekunders pulser skilt med 20 millisekunder. Dette bør være tilstrekkelig til å såre epidermis. Vent et øyeblikk og observere den lokale forstyrrelsen av cytoplasma, som vil vises som boblende. Hvis en fluorescerende markør er tilstede, kan lokalisert bleking observeres.
