Encyclopedia of Experiments: Biology
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- Para começar, transfira os vermes adultos jovens em uma almofada de agarose fresca em um slide. Em seguida, adicione algumas gotas de 12 milimolars de solução de levamisole para paralisar os vermes. Cubra os vermes com um tapa de cobertura e espere por alguns minutos. Coloque o slide sob um microscópio confocal de disco giratório e concentre-se na superfície lateral mais externa do verme.
A epiderme de um verme adulto é uma fina estrutura de camada única que consiste em sincitia multinucleada que resulta de eventos de fusão celular.
Em seguida, ferida a superfície apical da epiderme com um laser. Citoplasma das células danificadas pode vazar, aparecendo como uma bolha no local da ferida.
A irradiação a laser tem uma vantagem sobre outras técnicas, como o ferimento da agulha, pois causa interrupção localizada da cutícula e células epidérmicas, sem danificar tecidos internos. No protocolo de exemplo, veremos o processo de ferimento a laser em C. elegans.
- Para ferir precisamente os nematoides, este protocolo usa um laser femtosecond ligado ao microscópio confocal de disco giratório. Varreduras de linha ou pontos usando lasers femtosegundos, como os de microscópios de dois fótons, também devem ser suficientes.
- Comece coletando 10 jovens adultos em uma almofada de ágar. Paralise-os em uma gota de dois microliter de 12 milimolas de solução de levamisole. Em seguida, cubra-os com um deslizamento de cobertura e espere alguns minutos enquanto eles paralisam.
- É essencial que um animal esteja completamente paralisado. 12 milimolas levamisole não afetará a resposta da ferida. No entanto, outros métodos de imobilização também podem ser utilizados.
- Certifique-se de que a potência laser femtosegundo está definida para 140 miliwatts, medida antes do objetivo, e a taxa de repetição de laser está em 80 mega-hertz. Agora, localize os vermes sob um microscópio confocal de disco giratório. Usando um objetivo de 100x com uma alta abertura numérica, concentre-se na epiderme sincicial anterior ou posterior lateral do worm alvo.
Focando-se na superfície apical da célula epidérmica, brilhe o laser por dois pulsos de 200 milissegundos separados por 20 milissegundos. Isso deve ser suficiente para ferir a epiderme. Espere um momento e observe a interrupção local do citoplasma, que aparecerá como borbulhante.
