Encyclopedia of Experiments: Biology
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- C. elegans wird als experimentelles Modell der Infektion durch Darmpathogene verwendet, die Krankheiten verursachen, zum Teil durch DieStörung der Darmbarriere, Erhöhung ihrer Durchlässigkeit. Um barrierefreie Integrität nach der Exposition gegenüber einem Bakterium oder einer chemischen Verbindung von Interesse zu quantifizieren, sammeln Würmer, indem sie sie von ihren Platten waschen.
Als nächstes legen Sie diese Würmer auf Agarplatten mit beschrifteten Lebensmitteln, die aus wärmeabgetötetem E. coli gemischt mit FITC-Dextran, einem hochmolekularen Polysaccharid mit einem fluoreszierenden Tag, bestehen.
Lassen Sie die Würmer die markierten Bakterien fressen. Diejenigen mit intakten Darmbarrieren werden die Nahrung schnell löschen, während bei Würmern mit durchlässigerem Darm der Fluoreszenzmarker über das Lumen des Organs hinausdringt.
Übertragen Sie Würmer in eine Formaldehydlösung, um die Tiere zu fixieren. Nach 1 bis 2 Minuten das Formaldehyd durch Montagemedien ersetzen.
Schließlich, Bild der Würmer durch fluoreszierende Mikroskopie. Beachten Sie, dass C. elegans Darmgranulat autofluoreszierend sind, so wird es Hintergrundsignal. Aber insgesamt, mehr Darmfluoreszenz zeigt höhere Durchlässigkeit.
Im Beispielprotokoll werden wir die Wirkung der Behandlung mit dem Biomolekül DIM auf die Darmdurchlässigkeit von Würmern untersuchen, die mit pathogenen Pseudomonas aeruginosa Bakterien infiziert sind.
- Bereiten Sie die FITC-dextran-ergänzten Platten durch Mischen von 2 Milliliter hitzeinaktiviertem E vor. coli mit 4 Milligramm FITC-Dextran. Fügen Sie 100 Mikroliter der Mischung zu jeder von 20 frischen NGM AgarPlatten hinzu und lassen Sie die Platten für eine Stunde auf einer sauberen Laborbank trocknen. Waschen Sie die Würmer nach 48 Stunden Behandlung mit S Buffer. Übertragen Sie sie auf FITC-dextran ergänzte Platten und auf NGM-Platten ohne FITC-Dextran und inkubieren Sie die Platten über Nacht.
Am nächsten Tag die Würmer mit S Buffer waschen und eine Stunde lang in der frischen NGM-Agarplatte kriechen lassen. Fügen Sie 50 Mikroliter 4% Formaldehyd in jeden Brunnen einer schwarzen 96-Well-Flachbodenplatte hinzu und übertragen Sie ca. 50 Würmer in jeden Brunnen. Nach 1 bis 2 Minuten entfernen Sie das gesamte Formaldehyd und fügen Sie 100 Mikroliter Montagemedium in jeden Brunnen ein.
- Formaldehyd ist eine giftige Chemikalie und sollte mit Vorsicht behandelt werden.
