Alimentazione FITC-Dextran: Un metodo per quantificare la permeabilità intestinale in C. elegans

- C. elegans è utilizzato come modello sperimentale di infezione da agenti patogeni intestinali che causano malattie, in parte, interrompendo la barriera intestinale, aumentandone la permeabilità. Per quantificare l'integrità della barriera dopo l'esposizione a un batterio o a un composto chimico di interesse, raccogliere i vermi lavandoli dalle loro piastre.

Quindi, posizionare questi vermi su piastre di agar con cibo etichettato composto da E. coli ucciso termicamente mescolato con FITC-dextran, un polisaccaride ad alto peso molecolare con un'etichetta fluorescente.

Permettete ai vermi di mangiare i batteri etichettati. Quelli con barriere intestinali intatte canneteranno rapidamente il cibo, mentre nei vermi con intestino più permeabile, il marcatore fluorescente penetrerà oltre il lume dell'organo.

Trasferire i vermi in una soluzione di formaldeide per fissare gli animali. Dopo 1 o 2 minuti, sostituire la formaldeide con mezzi di montaggio.

Infine, immaginiamo i vermi mediante microscopia fluorescente. Si noti che i granuli intestinali C. elegans sono autofluorescenti, quindi ci sarà un segnale di fondo. Ma nel complesso, una maggiore fluorescenza intestinale indica una maggiore permeabilità.

Nel protocollo di esempio, testeremo l'effetto del trattamento con il DIM biomolecolare sulla permeabilità intestinale dei vermi infetti da batteri patogeni Pseudomonas aeruginosa.

- Preparare le piastre integrate da FITC-dextran mescolando 2 millilitri di E inattivato termicamente. aggiungere 100 microlitri della miscela a ciascuna delle 20 piastre di agar NGM fresche e lasciare asciugare le piastre per un'ora su un banco di laboratorio pulito. Dopo 48 ore di trattamento, lavare i vermi con S Buffer. Trasferirli su piastre integrate FITC-dextran e su piastre NGM senza FITC-dextran e incubare le piastre durante la notte.

Il giorno successivo, lavare i vermi con S Buffer e consentire loro di strisciare nella piastra di agar NGM fresca per un'ora. Aggiungere 50 microlitri di formaldeide al 4% ad ogni pozzo di una piastra nera a fondo piatto da 96 po 'e trasferire circa 50 vermi in ogni pozzo. Dopo 1-2 minuti, rimuovere tutta la formaldeide e aggiungere 100 microlitri di mezzo di montaggio in ogni pozzo.

- La formaldeide è una sostanza chimica tossica e deve essere maneggiata con cura.