FitC-Dextran Кормление: Метод количественной оценки проницаемости кишечника в C. elegans

- C. elegans используется в качестве экспериментальной модели инфекции кишечных патогенов, которые вызывают болезни, в частности, путем нарушения кишечного барьера, увеличивая его проницаемость.

Затем поместите этих червей на агарные пластины с помеченной пищей, состоящей из убитой жарой кишечной палочки, смешанной с FITC-декстраном, полисахаридом высокого молекулярного веса с флуоресцентным тегом.

Разрешить червей есть помеченные бактерии. Те, с нетронутыми кишечных барьеров будет быстро очистить пищу, в то время как у червей с более проницаемым кишечником, флуоресцентный маркер будет проникать за люмен органа.

Передача червей в раствор формальдегида, чтобы исправить животных. Через 1 до 2 минут, заменить формальдегид с монтажом средств массовой информации.

Наконец, изображение червей с помощью флуоресцентной микроскопии. Обратите внимание, что кишечные гранулы C. elegans являются аутофторесцентными, поэтому будет фоновый сигнал. Но в целом, больше кишечной флуоресценции указывает на более высокую проницаемость.

В примере протокола мы проанализируем влияние лечения биомолекулой DIM на проницаемость кишечника червей, инфицированных патогенными бактериями Pseudomonas aeruginosa.

- Подготовка FITC-декстран-дополненные пластины путем смешивания 2 миллилитров тепло-инактивированных Е. палочка с 4 миллиграммами FITC-декстрана. Добавьте 100 микролитров смеси к каждой из 20 свежих пластин NGM agar и позвольте пластинам высохнуть в течение одного часа на чистой лабораторной скамейке. После 48 часов лечения, мыть червей с S Buffer. Перенесите их в FITC-декстран дополненные пластины и NGM пластины без FITC-dextran и инкубировать пластины.

На следующий день, мыть червей с S Buffer и позволить им ползать в свежем NGM агар пластины в течение одного часа. Добавить 50 микролитров 4% формальдегида на каждый колодец черного 96-ну плоским дном пластины и передачи около 50 червей в каждый колодец.

- Формальдегид является токсичным химическим веществом и должны рассматриваться с осторожностью.