FITC-Dektran Besleme: C. eleganlarda Bağırsak Geçirgenliğini Ölçme Yöntemi

- C. elegans, kısmen bağırsak bariyerini bozarak, geçirgenliğini artırarak hastalığa neden olan bağırsak patojenleri tarafından deneysel bir enfeksiyon modeli olarak kullanılır. Bir bakteriye veya kimyasal bileşik ilgi çekici bir bileşiğe maruz kalındıktan sonra bariyer bütünlüğünü ölçmek için solucanları tabaklarından yıkayarak toplayın.

Daha sonra, bu solucanları, floresan etiketli yüksek moleküler ağırlıklı bir polisakkarit olan FITC-dextran ile karıştırılmış ısıdan öldürülmüş E. coli'den oluşan etiketli yiyeceklerle agar plakalarına yerleştirin.

Solucanların etiketli bakterileri yemesine izin verin. Sağlam bağırsak bariyerleri olanlar yiyecekleri hızla temizlerken, daha geçirgen bağırsaklara sahip solucanlarda floresan belirteç organın lümeninin ötesine nüfuz edecektir.

Solucanları hayvanları düzeltmek için formaldehit çözeltisine aktarın. 1 ila 2 dakika sonra formaldehiti montaj ortamıyla değiştirin.

Son olarak, solucanları floresan mikroskopi ile görüntüleyin. C. elegans bağırsak granüllerinin otofluoresan olduğunu unutmayın, bu nedenle arka plan sinyali olacaktır. Ancak genel olarak, daha fazla bağırsak floresan daha yüksek geçirgenliğe işaret eder.

Örnek protokolde, biyomolekül DIM ile tedavinin patojenik Pseudomonas aeruginosa bakterisi ile enfekte olmuş solucanların bağırsak geçirgenliği üzerindeki etkisini test edeceğiz.

- FITC-dektran takviyeli plakaları 2 mililitre ısı inaktif E karıştırarak hazırlayın. 4 miligram FITC-dextran ile coli. 20 taze NGM agar plakasının her birine karışımdan 100 mikrolitre ekleyin ve plakaların temiz bir laboratuvar tezgahında bir saat kurumasını bekleyin. 48 saatlik tedaviden sonra solucanları S Buffer ile yıkayın. Fitc-dextran takviyeli plakalara ve FITC-dextran içermeyen NGM plakalarına aktarın ve plakaları bir gecede kuluçkaya bırakın.

Ertesi gün, solucanları S Buffer ile yıkayın ve taze NGM agar plakasında bir saat boyunca sürünmelerine izin verin. Siyah 96 kuyulu düz tabanlı bir plakanın her kuyusuna% 4 formaldehitten 50 mikrolitre ekleyin ve her kuyuya yaklaşık 50 solucan aktarın. 1 ila 2 dakika sonra, tüm formaldehitleri çıkarın ve her kuyuya 100 mikrolitre montaj ortamı ekleyin.

- Formaldehit toksik bir kimyasaldır ve özenle ele alınmalıdır.