Gonad Microinjection: Een methode van samengestelde levering direct in de kiembaan van C. elegans

- Om de injectie voor te bereiden, gebruikt u een wormpriem om een spoor van halocarbonolie op een agarosepad te leggen. Plaats wormen in de olie en immobiliseer ze door ze voorzichtig op de agarpad te duwen. Zorg ervoor dat de olie de dieren volledig bedekt. Het zorgt ervoor dat zuurstof bij de wormenkan komen terwijl uitdroging wordt voorkomen. Plaats vervolgens de agarose-pad op een injectiemicroscoop en plaats de naald loodrecht op de worm, gericht op het distale uiteinde van een geslachtsarm. 

Duw de naald voorzichtig door de nagelriem en injecteer de geslachtsklierarm met het nucleïnezuur of de verbinding van belang. Elke gonadearm bevat een kiembaansynchronytium dat zich zal ontwikkelen tot individuele oöcyten. Materiaal dat in de distale gonade wordt geïnjecteerd, wordt in die oöcyten opgenomen en beïnvloedt de volgende generatie.

Na het injecteren van wormen, vervang de olie door M9 buffer. Zodra de wormen beginnen te bewegen, breng ze over naar een NGM agar plaat met bacterieel voedsel. In het volgende protocol, de gonade micro-injectie methode wordt gebruikt om een Cas9 complex te leveren om het dpy-10 gen te richten en te bewerken.

- Begin met de voorbereiding van C. elegans en agarose pads zoals beschreven in het tekstprotocol. Plaats een agarose injectiekussen en dek slip op een dissectie scope. Gebruik een worm pick om een klein spoor van halocarbon olie langs een rand van de pad te leggen. Gebruik vervolgens de worm pick bedekt met olie om verschillende wormen van de NG agar plaat en in het spoor van olie te tillen. Met een fijn haar bevestigd aan een pipet, zoals een wimper of kat whisker, positie. één worm tegelijk monteren en injecteren.

Eenmaal in positie en bevestigd aan de pad, bedekt u de wormen met nog een paar druppels halocarbon-olie vanaf de punt van de wormpriem. Plaats de afdekslip met de gemonteerde wormen op de injectiemicroscoop. Plaats de wormen onder een lage vergroting loodrecht op de injectienaald, die is gevuld met de RNP-oplossing, zoals beschreven in het tekstprotocol.

Schakel over op een hoge vergroting en plaats de naald naast de geslachtsklierarm, die overeenkomt met het gebied in de buurt van de kernen in het midden- tot laat- pachytene. Beweeg de naald met behulp van de micromanipulator tegen de worm en druk de nagelriem iets in. Tik vervolgens met één hand op de zijkant van het microscoopstadium om de naald door de nagelriem te bewegen. Druk het injectiepedaal of de knop in, vul langzaam aan de gonadearm met de injectiemix en verwijder de naald.

Zodra de wormen zijn geïnjecteerd, verwijdert u de afdeklip in de agarose pad en plaatst u deze onder een ontledende microscoop. Met behulp van een getrokken capillaire pipet verplaatst u de olie van de wormen door er een M9-buffer overheen te pipeten. Voer deze behandeling uit om de wormen uit de agar te bevrijden. Na 10 minuten, wanneer de wormen in de buffer rondslingeren, verplaatst u ze naar een NG-agarplaat met OP50-bacteriën met behulp van de getrokken capillaire pipet. agarplaten met OP50 Breng de platen vervolgens over naar een incubator van 25 graden Celsius.