Микроинъекция Гонада: Метод доставки соединения непосредственно в зародыш C. elegans

- Чтобы подготовиться к инъекции, используйте червя выбрать, чтобы заложить трек галоуглеродного масла на агарозной площадке. Место червей в масле и обездвижить их, осторожно толкая их на агар площадку. Убедитесь, что масло полностью охватывает животных. Это позволяет кислороду, чтобы добраться до червей при предотвращении высыхания. Далее, поместите агарозную площадку на инъекционный микроскоп и положение иглы перпендикулярно червя. 

Аккуратно протолкнуть иглу через кутикулу и ввести гонад руку с нуклеиновой кислотой или соединением интереса. Каждая гонадная рука содержит зародышевой синцитий, который будет развиваться в отдельные яйцеклетки. Материал, введенный в дистальный гонад, будет включен в эти яйцеклетки и повлияет на следующее поколение.

После инъекций червей замените масло буфером M9. Как только черви начнут двигаться, перенесите их на агарную пластину NGM с бактериальной пищей. В следующем протоколе метод микроинъекции гонад используется для доставки комплекса Cas9 для таргетинга и редактирования гена dpy-10.

- Начните с подготовки C. elegans и агарозы колодки, как описано в текстовом протоколе. Место агарозы инъекции площадку и крышка скольжения на вскрытии области. Используйте червя выбрать, чтобы заложить небольшой трек галоуглеродного масла вдоль одного края площадки. Затем, используйте червя забрать покрытием в масле, чтобы снять несколько червей от NG агар пластины и в треке масла. С тонкой волосы, прикрепленные к пипетке, такие как ресницы или кошки усы, положение червей параллельно мягко толкая червей в агарозы площадку. монтировать и вводить один червь за один раз.

Оказавшись в положении и прикрепленном к колодке, наложить червей еще несколькими каплями галоуглеродного масла с кончика червя выбрать. Поместите крышку скольжения с установленными червями на инъекционный микроскоп. Под низким увеличением, положение червей перпендикулярно инъекционной иглы, которая была заполнена раствором RNP, как описано в текстовом протоколе.

Переключитесь на высокое увеличение и перепозиционировать иглу, прилегающую к гонадной руке, соответствующие области вблизи ядер в середине-конце pachytene. Использование микроманипулятора, переместить иглу против червя, угнетая кутикулу немного. Затем, с одной стороны, нажмите сторону стадии микроскопа, чтобы трясти иглу через кутикулу. Депрессия педаль инъекции или кнопку, медленно заполнить, чтобы гонад руку с инъекционной смеси, и удалить иглу.

После введения червей снимите крышку в агарозной площадке и поместите ее под рассеченный микроскоп. вытеснить масло из червей, трубя буфер M9 над ними. Выполните эту обработку, чтобы освободить червей от агара. Через 10 минут, когда черви обмолота вокруг в буфере, переместить их в NG агар пластины с бактериями OP50 с помощью вытащил капиллярной пипетки. Место пластины на 20 градусов по Цельсию в течение двух-трех часов, пока черви не оправились и движутся вокруг. агар пластины с OP50 Затем передать пластины на 25 градусов по Цельсию инкубатор.