Microinjection des oisons : une méthode d’administration de composés directement dans la germline de C. elegans

- Pour se préparer à l’injection, utiliser un pic à vers pour poser une trace d’huile d’halocarbone sur un coussin d’agarose. Placer les vers dans l’huile et les immobiliser en les poussant doucement sur la garniture d’agar. Assurez-vous que l’huile recouvre entièrement les animaux. Elle permet à l’oxygène d’atteindre les vers tout en empêchant la dessication. Ensuite, placez la garniture agarose sur un microscope à injection et placez l’aiguille perpendiculairement au ver, en ciblant l’extrémité distale d’un bras gonad.  

Poussez doucement l’aiguille à travers la cuticule et injectez le bras de la gonad avec l’acide nucléique ou le composé d’intérêt. Chaque bras gonad contient un syncytium germinal qui se développera en ovocytes individuels. Les matières injectées dans la 9e distale seront incorporées dans ces ovocytes et affecteront la prochaine génération.

Après l’injection de vers, remplacez l’huile par un tampon M9. Une fois que les vers commencent à bouger, transférez-les dans une plaque d’agar NGM avec des aliments bactériens. Dans le protocole suivant, la méthode de microinjection de la 9e est utilisée pour fournir un complexe Cas9 pour cibler et modifier le gène dpy-10.

- Commencez par la préparation des coussinets C. elegans et agarose tels que décrits dans le protocole de texte. Placez une plaquette d’injection d’agarose et couvrez-vous sur une portée de dissection. Utilisez un pic de ver pour poser une petite trace d’huile d’halocarbone le long d’un bord de la garniture. Ensuite, utilisez le pic de ver enduit d’huile pour soulever plusieurs vers de la plaque d’agar NG et dans la piste de l’huile. Avec un cheveu fin attaché à une pipette, comme un cil ou une moustache de chat, placez les vers en parallèle en poussant doucement les vers dans le coussin d’agarose. Jusqu’à ce qu’ils soient à l’aise avec la procédure de microinjection, seulement monter et injecter un ver à la fois.

Une fois en position et attaché à la garniture, superposer les vers avec quelques gouttes d’huile d’halocarbone de la pointe du pic de ver. Placez le bordereau de couverture avec les vers montés sur le microscope d’injection. Sous un faible grossissement, placez les vers perpendiculairement à l’aiguille d’injection, qui a été remplie de la solution RNP, telle que décrite dans le protocole de texte.

Passer à un grossissement élevé et repositionner l’aiguille adjacente au bras de la 9e, correspondant à la région près des noyaux au milieu et à la fin du pachytene. À l’aide du micromanipulateur, déplacez l’aiguille contre le ver, déprimant légèrement la cuticule. Puis, d’une main, appuyez sur le côté du stade du microscope pour secouer l’aiguille à travers la cuticule. Déprimez la pédale ou le bouton d’injection, remplissez lentement pour gonad le bras avec le mélange d’injection, et retirez l’aiguille. Répétez l’étape avec l’autre bras gonad.

Une fois que les vers sont injectés, retirez le coverslip dans la garniture d’agarose et placez-le sous un microscope disséquant. À l’aide d’une pipette capillaire tirée, déplacez l’huile des vers en pipetting un tampon M9 au-dessus d’eux. Effectuez ce traitement pour libérer les vers de l’agar. Après 10 minutes, lorsque les vers se bousillent dans le tampon, déplacez-les vers une plaque d’agar NG avec des bactéries OP50 à l’aide de la pipette capillaire tirée. Placez la plaque à 20 degrés Celsius pendant deux à trois heures jusqu’à ce que les vers se soient rétablis et se déplacent. Une fois récupérés, transférez individuellement les vers à NG plaques d’agar avec OP50 Puis, transférer les plaques à un incubateur de 25 degrés Celsius.