Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Oprettelse af ekstrakromosomale DNA-arrays ved mikroinjection - den enkleste metode til at generere transgene ormstammer - resulterer i genetiske elementer, der ikke overføres stabilt under celledeling og derfor udviser variable arvehastigheder og udtryksniveauer.
For at gøre dette skal du starte med en alderssynkron synkroniseret population af L4 transgene orme, som bærer et ekstrakromosomalt array, der tidligere blev introduceret ved mikroinjection og giver dem mulighed for at vokse til gravide voksne. Overfør disse voksne til nye plader og lad dem lægge æg, indtil der er mindst 30 æg på hver plade. Fjern de voksne og lad æggene vokse op, indtil de når L4-fasen. Derefter bestråle ormene med UV-lys. Dette forårsager tilfældige dobbeltstrengsbrud i det genomiske DNA, hvor ormene DNA-reparationsmaskiner kan vilkårligt inkorporere arrayet.
Efter en genopretningsperiode natten over skal du tælle antallet af overlevende orme. En lille procentdel af døde orme indikerer effektiv bestråling. Overhold efterfølgende generationer for at isolere homozygotiske integrerede transgene linjer. I eksempelprotokollen integrerer vi et ekstrakromosomsystem med en fluorescerende co-injektionsmarkør udtrykt i pharynx.
- Vurder transmissionshastigheden for den transgene linje, der skal integreres. For hver transgen linje skal du vælge 10 fluorescerende gravide voksne på 10 separate dyrkningsplader under et fluorescerende stereoskop.
Overvåg afkomet hver dag for at vurdere, hvilket udviklingsstadium co-injektionsmarkøren udtrykkes og bedst kan observeres. Ved hjælp af fluorescerende stereoskopi skal du evaluere afkomets transmissionshastighed ved at bestemme procentdelen af fluorescerende afkom.
Få en population af transgene dyr synkroniseret på L4 larvestadiet til integration. Vælg 30 fluorescerende gravide voksne på fem kulturplader. Efter ormene har lagt æg i tre til fire timer ved 15 grader Celsius, skal du kontrollere for tilstedeværelsen af mindst 30 æg pr. Plade og derefter fjerne de voksne fra pladerne.
Kultur dyrene i en orm inkubator, indtil afkom nå L4 larve fase. Placer hver plade, der indeholder 15 til 20 fluorescerende transgene L4 dyr i en UV crosslinker med lågene fjernet.
Til genopretning inkuberes de bestrålede orme natten over ved 15 grader Celsius. Kontroller for antallet af dyr, der er i live. I vores hænder er en overlevelsesrate på omkring 80% til 90% adaptiv for en effektiv bestråling.
