यूवी विकिरण: एक्स्ट्राक्रोमोमोमल एरे को एकीकृत करने की एक विधि

- माइक्रोइंजेक्शन द्वारा एक्स्ट्राक्रोमोमोमल डीएनए सरणी बनाना-- ट्रांसजेनिक कृमि उपभेदों को उत्पन्न करने का सबसे सरल तरीका -- आनुवंशिक तत्वों में परिणाम जो कोशिका विभाजन के दौरान स्थिर रूप से प्रेषित नहीं होते हैं और इसलिए, चर विरासत दरों और अभिव्यक्ति के स्तर को प्रदर्शित करते हैं। सरणी को गुणसूत्र में एकीकृत करने का लक्ष्य इस आनुवंशिक अस्थिरता और परिवर्तनशीलता को कम करना है।

ऐसा करने के लिए, एल 4 ट्रांसजेनिक कीड़े की उम्र-सिंक्रोनाइज्ड आबादी के साथ शुरू करें, जो पहले माइक्रोइंजेक्शन द्वारा पेश की गई एक एक्सट्राक्रोमोमोमल सरणी ले जाती है और उन्हें ग्रेविड वयस्कों में विकसित होने की अनुमति देती है। इन वयस्कों को नई प्लेटों में स्थानांतरित करें और उन्हें अंडे डालने की अनुमति दें जब तक कि प्रत्येक प्लेट पर कम से कम 30 अंडे न हों. वयस्कों को हटा दें और अंडे को एल4 चरण तक पहुंचने तक बढ़ने दें। फिर, यूवी लाइट के साथ कीड़े को विकिरणित करें। यह जीनोमिक डीएनए में यादृच्छिक डबल-स्ट्रैंड ब्रेक का कारण बनता है जहां कीड़े डीएनए मरम्मत मशीनरी मनमाने ढंग से सरणी को शामिल कर सकती है।

एक रात की वसूली अवधि के बाद, जीवित कीड़े की संख्या गिनती । मृत कीड़े का एक छोटा प्रतिशत कुशल विकिरण इंगित करता है । होमोज़िगस एकीकृत ट्रांसजेनिक लाइनों को अलग करने के लिए बाद की पीढ़ियों का निरीक्षण करें । उदाहरण प्रोटोकॉल में, हम एक उच्च संचरण दर एक्स्ट्राक्रोमोमोमल सरणी को एकीकृत करेंगे जिसमें फ्लोरोसेंट सह-इंजेक्शन मार्कर व्यक्त किया गया है ।

- ट्रांसजेनिक लाइन की ट्रांसमिशन दर को एकीकृत करने के लिए मूल्यांकन करें। प्रत्येक ट्रांसजेनिक लाइन के लिए, फ्लोरोसेंट स्टीरियोस्कोप के तहत 10 अलग-अलग संस्कृति प्लेटों पर 10 फ्लोरोसेंट ग्रेविड वयस्कों को चुनें। एक कृमि इनक्यूबेटर में जानवरों को आनुवंशिक पृष्ठभूमि के प्रजनन के लिए अनुमेय तापमान पर सेट करें।

प्रत्येक दिन संतान की निगरानी करें ताकि यह मूल्यांकन किया जा सके कि सह-इंजेक्शन मार्कर किस विकासात्मक चरण को व्यक्त किया गया है और इसे सबसे अच्छा देखा जा सकता है। फ्लोरोसेंट स्टीरियोस्कोपी का उपयोग करके, फ्लोरोसेंट संतान के प्रतिशत का निर्धारण करके संतान की पारेषण दर का मूल्यांकन करें। ट्रांसजीन एकीकरण के लिए, उच्चतम पारेषण दर के साथ ट्रांसजेनिक लाइन का चयन करें।

एकीकरण के लिए एल4 लार्वा चरण में ट्रांसजेनिक जानवरों की आबादी प्राप्त करें। 30 फ्लोरोसेंट ग्रेविड वयस्कों को पांच संस्कृति प्लेटों पर चुनें। कीड़े के बाद 15 डिग्री सेल्सियस पर तीन से चार घंटे के लिए अंडे रखे हैं, प्लेट द्वारा कम से कम 30 अंडों की उपस्थिति की जांच करें, और फिर, प्लेटों से वयस्कों को खत्म करें।

जानवरों को कीड़ा इनक्यूबेटर में तब तक कल्चर करें जब तक कि संतान एल4 लार्वा स्टेज तक न पहुंच जाए। 15 से 20 फ्लोरोसेंट ट्रांसजेनिक एल4 जानवरों वाली प्रत्येक प्लेट को यूवी क्रॉसलिंकर में रखें जिसमें ढक्कन हटा दिए जाते हैं। कीड़े को विकिरणित करें।

वसूली के लिए, विकिरणित कीड़े को रात भर 15 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें । जीवित जानवरों की संख्या की जांच करें । हमारे हाथों में, लगभग ८०% से ९०% की जीवित रहने की दर एक कुशल विकिरण के लिए अनुकूली है । 15 से 25 डिग्री सेल्सियस पर विकिरणित जानवरों को विकसित करना जब तक संतान विकासात्मक चरण तक पहुंच नहीं जाता, तब तक सह-इंजेक्शन मार्कर अभिव्यक्ति के अवलोकन के लिए अनुमति देता है ।