Whole-Cell Patch Clamp Elektrofysiologi: En metode til at studere elektriske egenskaber neuroner

- Start med at placere et optagelseskammer, der indeholder en prøve i en badeopløsning, hvis sammensætning svarer til det fysiologiske ekstracellulære miljø eller cytoplasmaet, på et mikroskopstadium.

Skift forsigtigt fra positivt til undertryk for at danne en tæt forsegling mellem membranen og pipetten. Sæt et holdepotentiale på forstærkeren for at opretholde cellen ved en konstant spænding.

Når cellemembranen brister, forårsager holdepotentialet strømmen af ioner gennem spændingsbegrænsede ionkanaler, At skabe et membranpotentiale, som registreres af indspilningselektroden.

- For at forberede plaster fastspænding, skal du begynde med at trække nogle patch klemme pipetter med tyndvægget borosilikat glas i en vandret puller. Pipette spids diametre er omkring 0,2 til 0,4 mikrometer efter brand polering til en glat kant, og skaft konus er omkring 4 millimeter lang.

Fyld pipettespidsen med intracellulær opløsning ved at dyppe spidsen i den intracellulære væske. Sæt derefter en sprøjtenål i pipetten og udvisl forsigtigt intracellulær opløsning fra sprøjten for at afslutte påfyldningen af pipetten. Fastgør pipetten til forstærkerhovedstadiet i elektrofysiologiopsætningen. Det er vigtigt at holde hovedstadiet i en ca. 45 graders vinkel på den vandrette akse, da dette sikrer en indgangsvinkel til pipetten, der er egnet til dannelse af højmodstandsforsegling med Mauthner-cellen.

Lige før pipetten sænkes ned i badeopløsningen, påføres en lille mængde positivt tryk på pipetten for at reducere risikoen for, at spidsen blokeres. Fortsæt med at nærme sig M-cellen med en lille mængde positivt tryk i pipetten. Det positive tryk skubber forsigtigt cellen fra side til side, og når det placeres straks over cellen, danner det en lille smilehul på cellemembranen.

Lad nu pipetten være på plads i et par sekunder for forsigtigt at rengøre celleoverfladen, så der kan dannes en stærk forsegling mellem pipetten og membranen. Slip derefter det positive tryk i pipetten for at starte forseglingen. En lille mængde undertryk kombineret med negativ pipettepotentiale resulterer i giga-ohm-tætninger, der dannes inden for få sekunder.

Efterfølgende skal du ændre holdepotentialet i forstærkeren til minus 60 millivolt. Brud cellemembranen med en række korte impulser af sugning. Registrer straks membranpotentialer og minimer kapacitanceartefakter. Kompenser cellekapacitancen og få adgang til modstand med 70% til 85%.

Adgangsmodstanden skal overvåges hvert 30. sekund til et minut, og hvis der er en ændring på 20% eller mere, skal du afbryde eksperimentet. Når eksperimentet er afsluttet, og der er indhentet nok data, skal du ofre embryoet ved at fjerne baghjernen med et par pincet.