Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Begynn med å plassere et opptakskammer som inneholder en prøve i en badeløsning, hvis sammensetning samsvarer med det fysiologiske ekstracellulære miljøet eller cytoplasmaet, på et mikroskopstadium. Før opptaksmikropipetten, en pipette som inneholder en sølvelektrode badet i en elektrolyttløsning, som etterligner de intracellulære forholdene, mot nevronen ved å påføre positivt trykk og ta kontakt med cellemembranen.
Bytt forsiktig fra positivt til negativt trykk for å danne en tett forsegling mellom membranen og pipetten. Sett et holdepotensial på forsterkeren for å opprettholde cellen ved konstant spenning.
Når cellemembranen brister, forårsaker holdepotensialet strømmen av ioner gjennom spenningsportede ionkanaler, skape et membranpotensial, som registreres av registreringselektroden. Registrer umiddelbart membranpotensialet. Opptakselektroden overfører signalet til tilbakemeldingsforsterkeren, som trekker membranpotensialet fra holdepotensialet - et oscilloskop, som presenterer en visuell visning av membranpotensialet, og en datamaskin. I følgende protokoll vil vi utføre en patch clamp måling på Mauthner-cellen i et sebrafiskembryo.
- For å klargjøre for patchklemme, begynn med å trekke noen patchklemmepipetter med tynnvegget borosilikatglass i en horisontal puller. Pipettespissdiametre er ca. 0,2 til 0,4 mikrometer etter brannpolering til en jevn kant, og skaftet er ca. 4 millimeter langt.
Fyll pipettespissen med intracellulær løsning ved å dyppe spissen i den intracellulære væsken. Sett deretter en sprøytenål inn i pipetten og utvis intracellulær løsning forsiktig fra sprøyten for å fullføre fyllingen av pipetten. Fest pipetten til forsterkerhodetrinnet i elektrofysiologioppsettet. Det er viktig å holde hodetrinnet i en omtrent 45 graders vinkel mot den horisontale aksen, da dette sikrer en inngangsvinkel for pipetten som er egnet for dannelsen av høymotstandstetninger med Mauthner-cellen.
Rett før pipetten senkes ned i badeløsningen, bruk en liten mengde positivt trykk på pipetten for å redusere sjansen for at spissen blokkerer. Fortsett å nærme seg M-cellen med en liten mengde positivt trykk i pipetten. Det positive trykket skyver forsiktig cellen fra side til side, og når den plasseres umiddelbart over cellen, danner en liten dimple på cellemembranen.
La nå pipetten være på plass i noen sekunder for å forsiktig rengjøre celleoverflaten slik at en sterk forsegling mellom pipetten og membranen kan dannes. Slipp deretter det positive trykket i pipetten for å starte forseglingen. En liten mengde negativt trykk, kombinert med negativ pipettepotensial, resulterer i giga-ohm tetninger som dannes i løpet av få sekunder.
Deretter endrer du holdepotensialet i forsterkeren til minus 60 millivolt. Rev opp cellemembranen med en rekke korte sugepulser. Registrer deretter umiddelbart membranpotensialer og minimer kapasitansartefakter. Kompenser cellekadensen og få tilgangsmotstand med 70% til 85%.
Tilgangsmotstand bør overvåkes hvert 30 sekund til et minutt, og hvis det er en endring på 20% eller mer, avbryte eksperimentet. Når eksperimentet er avsluttet og nok data er samlet inn, ofre embryoet ved å fjerne hindbrain med et par tang.
